7. Підготовка до дослідження

7.1. Приготування розчинів та реактивів

7.1.1. Пептонно-сольовий розчин	За ГОСТ 26669
7.1.2. Ізотонічний (0,85% водний) розчин хлориду натрію	За ГОСТ 26669
7.1.3. Розчини і реактиви для постановки реакції нітратредукції	За ГОСТ 10444.8-99
7.1.4. Розчини і реактиви для фарбування препаратів за Грамом	За ГОСТ 10444.1 або відповідно до інструкції щодо застосування
7.1.5.Розчин перекису водню 3 % для визначення каталази	За ГОСТ 30425

7.2. Приготування поживних середовищ

Загальні вимоги до виготовлення ПС викладені в ГОСТ 10444.1 - 84.

З метою підвищення достовірності та якості досліджень, перевагу слід віддавати ПС та діагностичним препаратам промислового виробництва, зареєстрованих та рекомендованих до використання в Україні.

ПС промислового виготовлення, названі в п. 6.3.2, готують відповідно до прописів на етикетці або відповідно до рекомендацій фірми виробника.

Допускається застосування ПС, приготовлених безпосередньо в лабораторії з окремих компонентів за п.п. 7.2.1 - 7.2.10.

Готові середовища розливають у стерильний посуд і зберігають у захищених від світла умовах при температурі (2-8)⁰С.

7.2.1. Поживний агар (МПА) з 1 % глюкози і поживний бульйон (МПБ) з 1 % глюкози готують відповідно до ГОСТ 10444.1.

7.2.2. Триптон-соєвий бульйон із дріжджовим екстрактом (TSYEB)/ Триптон-соєвий агар із дріжджовим екстрактом (TS YEA).

Склад (г/дм³): гідролізат казеїну - 17,0; папаїновий перевар соєвого борошна -3,0; натрій хлористий - 5,0; калію гідрофосфат - 2,5; глюкоза - 2,5; дріжджовий екстракт - 6,0; агар-агар (для TSYEA) - 15,0.

Компоненти розчиняють у 1 дм³ дистильованої води, ретельно перемішують, установлюють рН (7,3±0,2) і автоклавують при (121±1)⁰С протягом 15 хвилин.

7.2.3. Середовища селективного збагачення типу бульйону Фрейзера.

Приготування основи середовища (г/дм³): ферментативний гідролізат казеїну - 5,0; пептон - 5,0; м'ясний екстракт - 5,0; дріжджовий екстракт - 5,0; натрію хлорид - 20,0; калію дигідрофосфат -1,35; натрію гідрофосфат - 12,0; ескулін - 1,0; літій хлористий -3,0, заліза амонійного цитрат -0,25 розчиняють у 1 дм³ дистильованої води, ретельно перемішують, встановлюють рН (7,2±0,2) і автоклавують при (121±1)⁰ С 15 хвилин.

Перед застосуванням до основи середовища додають асептично розчин селективних компонентів наступного складу:

Середовище типу бульйону Фрейзера
первинного збагачення*		вторинного збагачення
налідиксова кислота	- 10 мг	- 20 мг
акрифлавіну гідрохлорид -	12,5 мг	- 25 мг

*Допускається при приготуванні середовища типу бульйону Фрезера первинного збагачення готувати основу середовища без додавання ескуліну та цитрату заліза амонійного.

Спосіб приготування: зазначені компоненти розчинити в 10 см³ стерильного 0,2 N гідроксиду натрію.

7.2.4. PALCAM-агар (поліміксин-акрифлавін-літію хлорид-цефтазидім-ескулін-манітол - агар) - селективне диференційно-діагностичне середовище для виділення лістерій.

Приготування основи середовища (г/дм³): пептон м'ясний ферментативний - 23,0; дріжджовий екстракт - 3,0; крохмаль - 1,0; натрію хлорид - 5,0; ескулін - 0,8; літію хлорид - 15,0; заліза амонію цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; маніт - 10,0; феноловий червоний - 0,08; агар -15,0 розчиняють у 1 дм³ дистильованої води, ретельно перемішують, установлюють рН (7,0±0,2) і автоклавують при (121±1)⁰С 15 хв.

До стерильної розплавленої основи середовища додають асептично розчин селективних компонентів наступного складу: акрифлавін - 0,005; поліміксин “В” - 100 000 од.; цефтазидім - 0,02 у 10 см³ стерильної дистильованої води.

Готове середовище розливають у стерильні чашки Петрі.

7.2.5. Селективне диференційно-діагностичне середовище для виділення лістерій типу Оксфордського агару.

Приготування основи середовища (г/дм³): пептон м'ясний ферментативний - 23,0; крохмаль кукурудзяний - 1,0; натрію хлорид - 15,0; ескулін - 1,0; літію хлорид - 15,0; заліза амонію цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; агар - 15,0 розчиняють у 1 дм³ дистильованої води, ретельно перемішують, установлюють рН (7,0±0,2) і автоклавують при (121±1)⁰С 15 хвилин.

До стерильної розплавленої основи середовища додають асептично розчин селективних компонентів наступного складу: акрифлавіну гідрохлорид - 0,005; циклогексамід - 0,4, колістину сульфат* - 0,02, цефатетан* - 0,002, фосфоміцин* - 0,01 мг у 10 см³ 50 % етанолу.

Готове середовище розливають у стерильні чашки Петрі.

*Допускається заміна комплексу перелічених антибіотиків на поліміксин у кількості 500 000 од. на 1 дм³.

4.2.6. Кров'яний агар. До розтопленого й охолодженого до 45-50⁰С поживного агару з 1 % глюкози (п. 7.2.1) додають 5 % об’єму дефібринованої крові тварин. Розливають по 15 см³ у чашки Петрі діаметром 90 мм і підсушують при (37±1)⁰С.

Посів роблять у теплі чашки.

7.2.7. Поживний агар з еритроцитами барана. Дефібриновану або стабілізовану цитратом кров барана центрифугують в асептичних умовах 30 хв. при 900 об/хв. Надосадову рідину зливають. Осад суспендують у стерильному фізіологічному розчині до первісного об’єму, додають у кількості 5 % об’єму до розтопленого й охолодженого до 45-50 °С поживного агару (п. 7.2.1). Розливають у чашки Петрі діаметром 90 мм по 15 см³, підсушують при (37±1)⁰С. Чашки використовують для посіву теплими.

7.2.8. Середовище для визначення рухливості: 20 г гідролізату казеїну ферментативного, 6 г пептону м'ясного ферментативного і 5 г агару розчиняють у 1 дм³ дистильованої води, установлюють рН (7,3±0,2), розливають у пробірки по 5-7 см³ і автоклавують при (121±1)⁰С 15 хвилин.

7.2.9. Середовища Гіса за ГОСТ 10444.1 з манітом, рамнозою, ксилозою. 10 г пептону ферментативного і 5 г натрію хлористого розчиняють у 1 дм³ дистильованої води і додають 10 г відповідного вуглеводу. Встановлюють рН (7,1±0,1), вносять 10 см³ індикатора Андреде (можливе використання індикатора бромкрезолового пурпурного, “ВР” і ін.), розливають у пробірки і стерилізують при (112±1)⁰С 20 хвилин.

7.2.10. Середовище для визначення лецитиназної активності лістерій. До поживного агару (п. 7.2.1) перед стерилізацією додають активоване вугілля, розтерте до порошкоподібного стану, до концентрації 0,5% (вага/об’єм). Жовток курячого яйця змішують з 150 см³ фізіологічного розчину і додають 5 % цієї суміші за об’ємом до стерилізованого й охолодженого до 40-50⁰С поживного агару. Розливають у чашки Петрі по 20 см³ і підсушують при (37±1)⁰С. Аналогічно готують середовище з жовтком, але без активованого вугілля.