5.Методи бактеріологічного та біохімічного вивчення менінгококів, пневмококів та гемофілів

5.1.Створення пiдвищеної концентрацiї вуглекислого газу для культивування посiвiв

Рекомендується при первинному видiленнi збудників менiнгіту з лiквору, кровi та одержаннi бiомаси.

З цією метою використовують СО₂-термостати, генератори GENbox з газпакетами. При відсутності СО₂-термостатів та генераторів GENbox з газпакетами для створення пiдвищеної концентрацiї СО₂ можна використовувати будь-який посуд з притертою кришкою, наприклад, ексикатор. Засiянi чашки розмiщують в серединi посудини догори дном, там же закрiплюють запалену свiчку висотою 2-3 см та накривають кришкою. До моменту затухання свiчки створюється пiдвищена концентрацiя СО₂ (7-10%). Пiсля цього посiви ставлять в термостат.

5.2.Проба на каталазу

Метод базується на здатності мікроорганізмів, що мають фермент каталазу, розщепляти перекис водню, утворюючи воду та кисень. Не можна використовувати для постановки тесту культуру, вирощену на кров’яному агарі, оскільки каталаза еритроцитів може давати хибно-позитивні результати.

На предметне скло наносять краплю 10% перекису водню, в неї скляною паличкою або платиновою петлею вносять культуру і розтирають круговими рухами. При позитивній реакції утворюється піна (бульбашки газу).

5.3.Проба на оксидазу

Для постановки тесту слід використовувати комерційні диски або смужки для визначення оксидази (такі як СІП для визначення оксидази, смужки для виявлення цитохромоксидази виробництва PLIVA-Lachema). За відсутності комерційних препаратів застосовують індофенольний метод або метод Ковача.

Дослідження проводять з тест-реактивами:

1.Індофенольний метод

Розчин А - α-нафтол –1,0г;

Спирт етиловий (96^о) - до 100 см³.

Розчин Б – N,N-диметил-п-фенілендіамін – 1,0г;

Спирт етиловий (96^о) - до 100 см³.

Інгредієнти розчинити, тест-реактиви зберігати в прохолодному темному місці розчин А – до 10 діб, розчин Б – не більше 1 дня.

Ці розчини можна безпосередньо наносити по краплі на колонію або просочити смужку фільтрувального паперу, на якому розтирають матеріал із мікробної колонії. Оксидазопозитивні культури через 0,5-1,0 хвилину дають темно-синє забарвлення.

2.Метод Ковача

Тетраметил-п-фенілендіаміну гідрохлорид –0,5г;

Дистильована вода – до 100 см³.

Розчинити реактив у воді, зберігати в холодильнику при температурі (6±2)^оС до 2 тижнів.

Смужку фільтрувального паперу просочують реактивом, на ній розтирають матеріал із колонії. Можна нанести краплю реактиву безпосередньо на ізольовану колонію. Оксидазопозитивні культури через 10-30 сек. дають рожеве з переходом у лілове забарвлення.

Добову агарову культуру наносять у вигляді штриха платиновою чи пластиковою петлею, або скляною чи дерев’яною паличкою або пастерівською піпеткою.

Щоразу при постановці тесту проводять контрольні дослідження з тест-культурами мікроорганізмів, які дають позитивну (Pseudomonas aeruginosa) і негативну (E.coli) реакції.

5.4.Визначення сахаролітичної активності

Для визначення сахаролітичної активності використовують комерційні ідентифікаційні набори такі як: МИКРО-ЛА-ТЕСТ (Нейсеріятест, Нефермтест, Стафітест, Стрептотест, Ентеротест та ін.) фірми Pliva-Lachema; API 20 NE, API 20 E, Rapid 20E, API Listeria, API Staph, API NH, API 20 STREP, API Candida та ін. виробництва bioMerieux (офіційний представник фірми bioMerieux в Україні СП “Бівакс”). Дослідження виконують за інструкцією до препаратів.

Можна також застосовувати iндикаторні паперові тест-системи. Для цього готують 1,5 см³ густої суспензiї дослiджуваної культури в iзотонiчному розчинi натрiю хлориду з рН 7,2, вносять її по 6 крапель в 5 пробiрок. В кожну з пробiрок помiщають iндикаторний диск з вуглеводом (глюкозою, сахарозою, лактозою, мальтозою, фруктозою або левульозою) та iндикатором феноловим червоним. Пробiрки заливають вазелiновим маслом i витримують в термостатi при температурi (371)⁰С. Про розщеплення вуглеводiв свідчить змiна кольору дискiв з малиново-червоного на жовтий. Облік результатiв можливий через 6-24 години. Диски з глюкозою, лактозою i сахарозою використовують з наборiв СIП для iдентифiкацiї ентеробактерiй або холерних вiбрiонiв.

При відсутності дисків або наборів використовують середовища з вуглеводами для визначення сахаролітичних властивостей.

5.5.Визначення продукції полісахаридів N. meningitidis

на агарі з 5% вмістом сахарози

Густо висівають культуру петлею на сектор чашки Петрі з сироватковим агаром, що містить 5% сахарози. Через 48 годин інкубації в термостаті при температурі (371)⁰С на поверхню вирощеної культури наносять 1 краплю водного розчину Люголя. Реакція вважається позитивною при утворенні бурого забарвлення вирощених колоній.

5.6.Йодний тест для N.sicca

Реакцію на йод визначають на культурі, вирощеній бляшками на середовищі для постановки вказаного тесту (див. Додаток 2). На культуру пастерівською піпеткою наносять 1 краплю 0,25% водного розчину йоду. Позитивна реакція (поява синього забарвлення бактеріальної маси) характерна тільки для виду N.sicca.

5.7.Визначення редукції нітратів.

Метод базується на здатності мікроорганізмів відновлювати солі азотної кислоти (нітрати) до солей азотистої кислоти (нітритів). Перед посівом менінгококів до нітратного бульйону додають 20% інактивованої сироватки. Посіви витримують в термостаті при (371)⁰С до 5-7 діб. Після інкубації в пробірку з культурою вносять 3 краплі реактиву Гріса (суміш розчинів №1 і №2) або Касаткіна.

Поява червоного забарвлення через 30 секунд після додавання реактивів Гріса або Касаткіна свідчить про редукцію нітратів до нітритів – реакція позитивна. Відсутність забарвлення свідчить про те, що реакція негативна або відбулося відновлення до послідуючих продуктів (аміаку, молекулярного азоту, оксиду азоту, гідроксиламіну). Тому при відсутності забарвлення в пробірку додають на кінчику скальпеля порошок металічного цинку і результат оцінюють знову:

-забарвлення не з’являється – нітрати в середовищі відсутні, оскільки відновлені бактеріями до нітритів і далі до послідуючих продуктів відновлення;

-з’являється червоне забарвлення – нітрати в середовищі редуковані до нітритів, але не бактеріями, а цинком (реакція негативна).