Механизмы свободно-радикального некробиоза.

Частично восстановленные (активные) кислородсодержащие радикалы (АКР) - это высокотоксичные химически реакционноспособные молекулы с нечетным количеством электронов, способные повреждать клеточные мембраны , хроматин и белки. Отнимая электроны у различных органических молекул, например, арахидоновой кислоты, свободные кислородные радикалы могут превратить их в перекисные соединения с неспаренными электронами и запустить своего рода цепные реакции (Н.Н. Семёнов, 1934) внутри клетки.

АКР - физиологические метаболиты и образуются в клетке при нормальном обмене веществ. Они вырабатываются в ЭПР ходе работы микросомальной окислительной системы цитохрома Р₄₅₀, при функционировании митохондрий с участием так называемого убисемихинона, в лизосомах и пероксисомах под действием мембранных НАДФН-зависимых оксидаз. Многие важные процессы, например генерация конечных продуктов пуринового обмена и распад дофамина, обязательно сопровождаются выработкой АКР. В ряде случаев, рецепторно-опосредованная стимуляция клеток сопровождается усилением продукции АКР. Многофункциональный паракринный сигнал - окись азота - сама является свободным радикалом и усиливает образование других АКР (см. выше). Наконец, умирающие клетки самоокисляются и могут воздействовать АКР на живых соседей.

Адренэргическая стимуляция физиологически приводит к усилению, а холинэргическая - к ослаблению продукции эндогенных АКР, противоположно изменяет редокс-потенциал клетки и создает условия для пермиссивного эффекта, когда один и тот же сигнал вызывает различный ответ клеток . в зависимости от их редокс-состояния. Так например, фактор некроза опухолей ФНО вызывает либо гибель клеток, либо их пролиферацию, так как зависимый от него фактор транскрипции NF-kb срабатывает только при определенном сдвиге окислительного потенциала клеток -мишеней.

АКР способны взаимодействовать с сульфгидрильными группами в составе белков, например, с остатками цистеина в их активных центрах, изменяя биологические функции ферментов и рецепторов. Благодаря этому АКР могут изменять активность факторов транскрипции и тирозиновых протеинкиназ , влиять на скорость связывания цитоплазматического кальция с кальмодулином и на активность кальциевой АТФазы, на чем и основана их способность модулировать клеточные ответы на различные сигналы. Редокс-состояние клетки, по А.Я. Кульбергу (1987), играет важную роль в управлении фазами клеточного цикла. Редокс-статус клеток находится, как и все механизмы реактивности, под генетическим контролем. Ген bcl-2, ранее упоминавшийся, как блокатор повышения цитоплазматической концентрации кальция, кодирует белок, присутствующий в местах основной продукции АКР и понижающий их выработку. Белок АРO-1, известный как индуктор клеточной гибели, наоборот, обладает прооксидантным действием

Осуществляя защитные реакции, клетки, особенно, специализированные мезенхимальные элементы - макрофаги и гранулоциты - могут многократно усиливать продукцию АКР. При фагоцитозе происходит так называемый “метаболический взрыв” в фагоцитах , то есть существенное усиление потребления энергии фагоцитирующей клеткой (Балдридж, Герард; 1933). Значительная часть этой энергии расходуется НАДФН-зависимыми оксидазами на образование супероксидного радикала:

О2 + е = О₂^-.

АКР осуществляют бактерицидный (цитоцидный) эффект в фаголизосомах. Так как, в отличие от лизосомальных гидролаз, АКР способны разрушать неповрежденные клеточные стенки бактерий и интактные мембраны клеток, кислородзависимый механизм завершающей стадии фагоцитоза , по современным представлениям ( Б.М.Бабёр, 1984) , намного более важен, чем гидролитический.

Миелопероксидаза фагоцитов (в частности, нейтрофилов и моноцитов крови) превращает перекись водорода и ионы хлора в высокобактерицидный гипохлорит-анион:

Н₂О₂ + Сl ^{- =} ClO^- + H₂O

АКР также секретируются вовне в процессе экзоцитоза, в расчете на их способность разрушать причинный агент первичной альтерации и, путем перекисного окисления мембран соседних клеток, осуществляют вторичное самоповреждение, а также способствуют выработке эйкозаноидных медиаторов воспаления. Врачи, с давних времен применяющие для дезинфекции йод, перекись водорода, щелок и хлорную известь - фактически , воспроизводят эволюционно сложившийся естественный бактерицидный механизм усиленной генерации таких соединений, как H₂O₂, 0H-, гипохлорит и оксийодиды, доступный любому фагоциту! Через АКР опосредуют свое действие фактор некроза опухолей и другие агенты , осуществляющие цитотоксические эффекты.

Поистине, индукторы цепных реакций АКР - это атомное оружие клеток в борьбе с носителями чужеродной генетической информации, проникающей в организм. Но длительное и значительное увеличение продукции АКР ведет к самоповреждению клеток.

Важнейший из АКР - супероксидный анион О_2 . Он образуется при неполном одноэлектронном восстановлении кислорода в ходе митохондриального аутоокисления , а также в микросомах из О2 под влиянием ксантиноксидазы, цитохрома Р₄₅₀ и других оксидаз, как показано выше.

Фермент супероксиддисмутаза превращает О²- в перекись водорода, используя протоны НАДФН:

O₂^-.+ O₂^-. + 2H+ = H₂O₂ + O₂

Тот же процесс протекает и спонтанно, но медленнее.

Перекись водорода возникает не только из супероксида, но и из воды и кислорода под действием каталазы в пероксисомах.

В присутствии меди или двухвалентного железа, образуемого при действии супероксида на Fe⁺³, перекись водорода распадается с образованием гидроксильного радикала (реакция Фентона):

Fe⁺² + H₂O₂ = Fe⁺³ + OH^- + HО^

Гидроксилы формируются и при действии супероксида на перекись водорода (реакция Хабера-Вейсса):

H₂O₂ + O₂- = OH^- + OH^. +O₂

Радиолиз и фотолиз воды служат важным дополнительным источником гидроксилов при облучении клеток. При определенных условиях образуются и другие АКР, в частности, синглетный кислород и оксигалиды. (гипохлорит и оксийодид). Они служат главными микробицидными агентами фагоцитов.

Оксид азота, сам относящийся к АКР, реагируя с О₂ дает супероксидный анион и перекись водорода. Окислительный стресс, вызванный избытком NO, участвует в гибели нейронов при инсульте.

Основными направлениями повреждающего действия АКР являются:

• перекисное окисление липидов плазматической и внутриклеточных мембран, приводящее к освобождению медиаторов воспаления и токсинов (например, малональдегида, эпоксидов, эндопероксидов)

• сшивка мембранных, внеклеточных и внутриклеточных липидов и белков через сульфгидрильные группы с инактивацией ферментов и рецепторов и образованием сульфид-радикалов, дисульфидов и сульфоновых кислот Процесс ведет к формированию белковых агрегатов (например, при катарактах хрусталика).

• повреждение ДНК , остановка ее репликации и мутагенез, что может вызвать тератогенный или канцерогенный, а также цитостатический эффект.

Особенно патогенно цепное перекисное окисление мембранных липидов.

Под воздействием АКР формируется инициирующий радикал липида:

LH + HO^. = H₂O + L^.

Липидный радикал и кислород дают липоперекись:

L ^.+ O₂ = LO₂^.

Липоперекись атакует соседнюю молекулу липида . формируя гидроперекись липида и новый липидный радикал и т.д.:

LO₂^{. +} LH = LOOH + L^.

Двухвалентное железо может превращать гидроперекиси липидов в алкоксильные свободные радикалы в молярном соотношении 1:2, разветвляя цепную реакцию на два радикалообразующих пути:

LOOH + Fe ⁺² = OH^- + Fe⁺³ + LO^.

Принято считать, что АКР - универсальные участники любых видов клеточной гибели, по крайней мере, на ее конечных этапах, когда происходит деструкция внутриклеточных мембран и освобождение АКР из компартментов клетки.

Однако, их относительный вклад при разных типах повреждения клеток неодинаков. При гипоксическом некробиозе АКР, хотя и образуются, например, вследствие кальций-зависимого повреждения митохондрий, но количество их не так велико, чтобы считать АКР-опосредованную альтерацию главным механизмом гипоксической смерти клетки.

Правда, необходимо, вслед за Котраном и Кумаром (1994) отметить, что если в ходе развития гипоксии произошло восстановление притока кислорода к некробиотическим клеткам, поврежденные митохондрии начинают вырабатывать АКР в значительных количествах . Именно это лежит в основе так называемого реперфузионного повреждения , которое хорошо известно кардиологам. Кардиомиоциты гибнут не на высоте ишемии, а после полного или частичного восстановления коронарного кровоснабжения, будучи не в состоянии устоять перед окислительным ударом АКР. Реперфузионные нарушения диктуют необходимость комплексного лечения при остром инфаркте миокарда: врач не ограничивается мерами, направленными на лизирование тромба и вазодилатацию, а комбинирует их с введением средств, эффективных при тканевой гипоксии .

Разрушающее действие АКР является ранним и мощным и выходит на первый план в механизмах некробиоза в ряде специальных случаев, когда гибель клеток имеет определенную этиологию.

Прежде всего, это ситуации , когда резко ускоряется собственная продукция АКР - воспаление, инфекционное повреждение клеток, иммунопатологический цитолиз, разрушение опухолевых, микробных и зараженных вирусами клеток иммунной системой, травматический шок и синдром длительного раздавливания, а также другие состояния с активным распадом пуринов.

Затем, это ситуации, когда повреждающий агент сам превращает воду и органические молекулы в свободные радикалы (радиационное поражение клеток, действие иприта и люизита, отравление кислородом и озоном, включая гипербарическую оксигенацию, гемохроматоз и отравление двухвалентным железом).

Наконец, это химическое повреждение клеток, при котором свободные радикалы формируются из молекул токсина или лекарства при их метаболизме (например, отравление четыреххлористым углеродом).

АКР особенно токсичны для клеток, богатых ненасыщенными липидами.

Генерация АКР всегда участвует в запрограммированной гибели клеток - вызванной самыми разными причинами ( например, в апоптозе лимфоцитов под действием как глюкокортикоидов , так и вируса СПИДа). Пути патогенного действия АКР отражены на рис. 37.

Легко заметить, что при всех вышеназванных процессах , когда гибель клетки идет с активным участием свободных радикалов отсутствует первичная гипоксия, или она не является глубокой. Показано что высокие концентрации АКР могут индуцировать некробиоз, но средние и малые концентрации тех же АКР ( например , перекиси водорода) способны включать программу апоптоза. Прооксидант 2,3-диметокси-1,4-нафтолхинон в малых концентрациях стимулирует пролиферацию клеток, в средних - запускает апоптоз, а в высоких - вызывает некроз.

По-видимому, свободнорадикальная гибель клетки, до известной степени, альтернативна описанному выше гипоксическому некробиозу, хотя имеет с ним много общего, включая почти идентичные финальные стадии.

Как и в случае с кальцием, грань между стимуляцией и повреждением - временная и количественная, и судьба клетки при активации АКР - это вопрос баланса. Таким образом, равновесие между генерацией и инактивацией АКР в клетке может устанавливаться на разном уровне - и это фундаментальная неспецифическая составляющая клеточной реактивности, модулирующая клеточные ответы на разнообразные конкретные стимулы. Биорегуляторы, перечисленные выше в таблице 4, все без исключения, так или иначе затрагивают баланс прооксидантных и антиоксидантных систем клетки.