40. Химические методы: измерение атф.

Измерение количества АТФ

Клетка

→ Экстарагирующий реагент

АТФ

→ Билюминесцентный реагент

Свет

Экстрагирующий реагент:

1. максимально полно извлекать реагент из клеток

2. не разрушать АТФ

3. минимально ингибировать билюминесцентную реакцию

Измерение количества АТФ:

- Характерное отличие от хемилюминесценции – участие в процессе преобразования энергии специфических ферментов – люцифераз, обеспечивающих крайне высокий энергетический выход реакции

- Отличительная особенность монооксидазной реакции, катализируемой люциферазой – она протекает с образованием интенсивной люминесценции в сине-зеленой области спектра (~490 нм)

- На каждую молекулу прореагировавшего субстрата (АТФ или ФМНН2) образуется от 0,3 до 1,0 квант свет

Изменение количества АТФ:

- другая важная особенность люциферазных реакций – абсолютная специфичность по отношению к нуклеатиду, поэтому предварительно разделять сложные смеси нет необходимости

- обеспечивает не только оценку суммарной микробиологической контаминации, но позволяет осуществлять контроль пищевых остатков.

- результаты на дисплее люминометра показываются условными единицами света (англ.RLU – RELATIVE LIGHT UNITS).

41. Биологические методы: иммунологические, молекулярно-генетические, методы фигерпринтинга.

Иммунологические методы:

- Серотипирование (опред. присутствия грам «-» микроорганизмов (эшерихии и сальмонеллы) и грам «+» (листерии)

- Иммунолюминесценция (АТ к известному антигену флуоресцентно метят, после обработки препарата такими мечеными антителами метку можно увидеть в УФ-свете. Данный метод стал использоваться редко из-за разработки новых более чувствительных методов)

- Радиоиммунологический анализ (заключается в радиоактивном мечении антигенов, которые затем взаимодействуют с антителами, затем измеряют количество связавшихся антигенов при помощи счетчика Гейгера)

- Диффузия через гель (для определения количества бактериальных токсинов и энтеротоксинов. Чувствительность метода – до 0,1-0,01 мкг/мл, продолжительность инкубации может быть около 6 сут.).

- Гемаглютинация (используют для определения энтеротоксинов с эритроцитами овцы)

Молекулярно-генетические методы:

- Для видовой идентификации бактерий по 16S-РНК

- Метод полинуклеотидных зондов (ДНК-зондов)

- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

- Lux-люминесценция (для морских бактерий)

Методы фингерпринтинга (обзорная хроматограмма, пептидная карта):

- фаготипирование (для ограниченного числа видов – L.nonocutogenes, S. aureus, E.coli, B.cereus).

- рестрикционный анализ

- гель-электрофорез в пульсирующем поле

- анализ с помощью микроматриц

42. Подсчет микроорганизмов. N = ΣC / V×1,1×d, где ΣC - сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 кол. V - объем посевного материала, внесенного в каждую чашку , см³.d - коэффициент разбавления, соответствующий первому разведению (d=1, если используется неразведенный жидкий продукт (проба для испытаний)

Результат округляют до двух значащих цифр. Если во всех чашках на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходного разведения (твердые продукты) содержится менее 10, но не менее 4, результат вычисляют по указанному выше. Если общее количество колоний составляет от 1 до 3 указывают: количество микроорганизмов менее (4×D) на г или мг. Если на чашке не выросли колонии: менее 1/d микроорганизмов на л или на 1 г.