38. Базовые микробиологические методы: метод нвч, метод восстановления красителей, прямой микроскопический подсчет.

Метод подсчета наиболее вероятного числа (НВЧ):

- Три серии разведений или аликвот вносят в 9 или 15 пробирок соответствующей среды

- Численность подсчитывают с помощью стандартных таблиц НВЧ

- Результат, как правило, выше, чем при стандартном подсчете колоний

Преимущества: - Относительная простота

- Хорошая сопоставимость при межлабораторных сличениях

- Возможность определять группы микроорганизмов

- Приемлемость для определения фекальных колиформ

Недостаток: - Необходимость в большом количестве посуды

- Невозможность наблюдать морфологию колоний

- Неточность

Использование техники восстановления красителей:

Обычно использую 2 красителя:

1. Метилен голубой (синий)

2. Резазурин

- Подготовленный супернатант из пищевого продукта добавляют к стандартному раствору того или иного красителя:

- Исчезновение синего цвета – метиленовый синий

- Переход от серо-голубого (синего) к розовому или белому цвету – резазурин

Прямой микроскопический подсчет: Готовят мазок экземпляра пищевого продукта на предметное стекло микроскопа, окрашивание и просмотр и подсчет микроорганизмов под микроскопом

Преимущества: - Быстрота

- Типовой

- Допускает использование флуоресцентных методов для повышения эффективности

Недостаток: - Утомителен аналитику

- Неселективен в отношении жизнеспособных микроорганизмов, частицы продукта можно спутать с клетками, клетки распределяются неравномерно, могут плохо окрашиваться

- Результаты, как правило, выше, чем результаты подсчета колоний

Бывает: 1. Темнопольная микроскопия

2. фазово-контрастная микроскопия

39.Физические микробиологические методы: биосенсоры, измерения сопративления среды, микрокалометрия, прямая цитометрия.

Физические методы:

- Биосенсоры

- Измерение сопротивления

- Микрокалориметрия

- Проточная цитометрия

- Анализ при помощи установки BioSys

Биосенсоры - устройство или метод, позволяющий установить наличие или активность микроорганизма, живого или убитого. К биосенсорам не относятся биохимические и иммунологические методы, основанные на реакции фермента с субстратом и АТ и АГ, хотя они м.б. составными частями биосенсоров

Виды:

- Пьезоэлектрические кристаллы (акустические биосенсоры). Пьезоэлектричество – возникновение электрического тока в результате механического давления на кристалл какого-либо вещества (кварц). Вибрирующий кристалл кварца – очень чувствителен к изменению массы. На кристалл кварца наносят АТ, а затем на него же наносят АГ. АГ связывается с АТ и происходит увеличение массы кристалла, который меняет свою частоту вибрации. Пороговая чувствительность – 1000 – 2100000 КОЕ/мл, продолжительность ответа – 25-40 мин.

- Оптоволоконные биосенсоры. Оптическое волокно – волновод, выполненный из стекла или полимеров, проводящий свет за счет полного внутреннего отражения. Используют оптический или электронный преобразователь для улавливания биологической реакции и преобразования ее в различимый оптический сигнал. Типичный биосенсор – клиновидный оптоволоконный зонд, покрытый антителами. Свет полупроводникового лазера проходит через всю систему оптических волокон и выходит на ее конце в виде исчезающей волны.

Измерение сопротивления. Основана на способности микроорганизмов в процессе роста расщеплять соединения с низкой электропроводностью и производить соединения с высокой электропроводностью, повышая тем самым общую электропроводность среды. Метод обладает чувствительностью порядка 10-100 клеток. При количестве клеток 10000-100000 /мл их присутствие обнаруживают через 5-7 ч.

Область применения:

- Количественная оценка степени микробного загрязнения

- Экспрессное определение санитарно-значимых микроорганизмов

- Скрининг патогенных микроорганизмов

- Сертификация пищевых продуктов и питьевой воды

- Контроль стерильности материалов и растворов

- Исследование активности стартовых культур

- Изучение влияния различных факторов на рост микроорганизмов

- Определение ингибирующих веществ

- Мониторинг окружающей среды

Преимущества: - Автоматическая регистрация и обработка результатов

- Сокращение времени исследования

- Простая подготовка образцов к исследованию

- Снижение затрат рабочего времени и материалов

- Высокая производительность системы

- Документация результатов

Микрокалориметрия: Основан на измерении энтальпии среды, которая изменяется вследствие метаболической активности растущих в ней микроорг-ов (производство тепла тесно связано с физиологической активностью клеток)

Два типа микрокалориметров:

1. Дискретные

2. Проточные

Метод используется для идентификации микроорг-ов, т.к. результаты микрокалориметрии зависят от микроорганизма, размера инокулята, субстратов и большого числа параметров. По виду термограмм можно различать разные виды микроорганизмов. Также используется для определения жизнеспособности восстановленных замороженных клеток.