6. Способы титрования бактериофага в жидкой и на плотной питательных средам. Получение больших количеств фага, фаголизат бактериальной культуры, ме­тоды его очистки.

Культивируют бактериофаги в жидких и плотных питательных средах, в которые засеяны соответствующие культуры бактерий. Существуют 2 метода титрования бактериофагов: метод по Аппельману (в жидкой питательной среде) и по Грациа (на плотной среде).

По Аппельману, титром в жидкой питательной среде называется то максимальное разведение, которое даёт полный лизис бактерий.

По Грациа, титр – количество активных фаговых частиц в пересчёте на 1 мл неразведённого фага. Количество активных фаговых частиц в 1 мл = количество зон лизиса * величина обратного разведения. Метод по Грациа более точный.

Для приготовления биопрепаратов из бактериофагов используют в основном три источника: лизогенные культуры бактерий, фекалии выздоравливающих больных, сточные воды. Для выделения дизентерийного бактериофага в сочных водах сначала проводят его индикацию методом фаговой дорожки. На чашку Петри с МПА засевают газоном культуру дизентерийных бактерий, затем на поверхность посева закапывают фильтрат сточной воды стекающей каплей. Посевы инкубируют в термостате в течение 18 часов. При положительном ответе проводят определение исходного титра бактериофага по Аппельману. Для титрования фага готовят его десятикратные разведения, в которые добавляют эталонную культуру дизентерийных бактерий (2 млрд. м. т. в 1 мл). Пробирки помещают в термостат на сутки. Учитывают исходный титр бактериофага. По Грациа, готовят десятикратные разведения фага, которые смешивают со стандартной культурой дизентерийных бактерий в объёме 0,1 мл каждое разведение бактериофага и расплавленным и слегка остуженным агаром. Полученную смесь выливают на чашку Петри с МПА вторым агаровым слоем и после застывания смеси инкубируют в термостате 24 часа. Подсчитывают количество «негативных колоний» бактериофага, умножают на степень разведения фага и объём из расчёта на 1 мл. Это и будет титр бактериофага по Грациа.

При необходимости получения больших количеств фага заражают фагом экспоненциально растущую в жидкой среде культуру бактерий. В результате ряда циклов развития фага большинство, а иногда и все клетки культуры лизируются. Затем оставшиеся в культуре клетки и их обломки удаляют с помощью низкоскоростного центрифугирования, а получившуюся жидкость стерилизуют либо фильтрованием, либо обрабатывая ее хлороформом. В результате получается стерильный лизат, который содержит обычно от 109 до 1012 фаговых частиц, которые освобождаются из клеток при лизисе.

7. Использование бактериофагов в медицине.

Одной из областей использования бактериофагов является антибактериальная терапия, альтернативная приёму антибиотиков. Например, применяются бактериофаги: стрептококковый, стафилококковый, клебсиеллёзный, дизентерийный поливалентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и другие. Бактериофаги применяются также в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция). Фаговые векторы обычно создают на базе умеренного бактериофага λ, содержащего ДНК. Размножение бактериофага возможно только в живых клетках. Бактериофаги могут быть использованы для определения жизнеспособности бактерий. Данное направление имеет большие перспективы, поскольку, одним из основных вопросов при разных биотехнологических процессах является определение жизнеспособности используемых культур. С помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий была показана возможность изучения этапов взаимодействия бактериофагов и микроорганизмов.