3.4.1 Унифицированный метод определения осмотической резистентности эритроцитов в модификации Идельсона

Принцип: Количественное определение степени гемолиза эритроцитов в за буферных гипотонических растворах хлорида натрия.

Реактив: основной раствор (27,31 г двузамещенного фосфата натрия Na;HPO<, 4,86 г однозамещенного фос­фата натрия NaH₂P04-2H₂0, 180 г хлорида натрия в 2 л дистиллированной воды); РН раствора 7,4.

По своей осмотической концентрации основной ра­створ соответствует 10% раствору хлорида натрия. Его разводят в 10 раз, получая рабочий раствор, осмотическая концентрация которого соответствует 1% раствору хлори­да натрия. Из рабочего раствора готовят разведения хлорида натрия следующих концентраций: 0,85; 0,75; 0,70; 0,65: 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20 и 0,10%. Можно готовить сразу по 100 мл этих растворов и хранить течение 2 нед в холодильнике.

Ход определения. В 2 стерильные пробирки, со­держащие по 2 капли гепарина, берут по 1,5 мл крови. 1-ю пробирку помещают на сутки в термостат, 2-ю — используют в день взятия крови.

В 14 центрифужных пробирок разливают по 5,0 мл приготовленных растворов с последовательно понижа­вшейся концентрацией. В 1-ю пробирку помещают 5,0 мл рабочего раствора с концентрацией 1%. В каждую пробир­ку прибавляют по 0,02 мл гепаринизированной крови, перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре (20° С). Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость из каждой про­бирки сливают в чистую пробирку с соответствующим номером.

Фотометрируют на ФЭКе при длине волны 500—560 нм ( зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против в холостой пробы.

Холостая проба – надосадочная жидкость в пробирке, содержащей 1 % раствор хлорида натрия.

Расчет. За 100% гемолиз принимают гемолиз в пробирке, содержащей 0,1 % раствор хлорида натрия. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, при­нятой за 100 %, по формуле:

Ех х 100

Е1

где Е1) — экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1 % раствором хлорида натрия; Е_х — экстинкция исследуемой пробы; 100 — про­цент гемолиза в пробирке с 0,1 % раствором хло­рида натрия.

На следующий день повторяют исследование с кровью, инкубированной 24 ч при 37 °С.

Нормальные величины. У здоро­вых в свежей крови начало гемолиза отмечают при концентрации хлорида натрия 0,48—0,46%, а полный гемолиз — при 0,34—0,32% растворе хлорида натрия.

Клиническое значение. Исследо­вание проводят при подозрении на гемолити­ческую анемию. Понижение осмотической ре­зистентности, т. е. появление гемолиза эритроци­тов при более высокой, чем в норме, концентра­ции хлорида натрия (0,70—0,75 %), наблюда­ется при наследственном микросфероцитозе и некоторых наследственных несфероцитарных ге­молитических анемиях, а также иногда при ауто­иммунной гемолитической анемии. В ряде случа­ев понижение осмотической резистентности вы­является только при исследовании инкубирован­ной крови. Повышение осмотической резистент­ности характерно для талассемии.