4.2.2. Выделение днк коммерческим набором*

_______________

* Приведен оптимизированный протокол выделения ДНК с помощью набора DNA Purification Kit (Promega, USA), включавшего Cell Lysis Solution, Nuclei Lysis Solution, RNase Solution, Protein Precipitation Solution, DNA Rehydration Solution, отличающийся от протокола производителя.

1) Подписать пробирки.

2) Приготовить образец для выделения ДНК:

3) Мазок костного мозга, селезенки, лимфатического узла, язвенных поражений, капля крови на предметном стекле: добавить 300 мкл раствора, лизирующего клетки ("Cell Lysis Solution") на материал, который находится на предметном стекле. Перемешать и скарифицировать, используя наконечник пипетки, затем перенести суспензию с поверхности предметного стекла в стерильную микроцентрифужную пробирку. Мягко смешать, переворачивая пробирки, инкубировать смесь 10 мин при комнатной температуре.

4) Образцы свежей крови: к 300 мкл крови, находящейся в пробирке, добавить 300 мкл раствора, лизирующего клетки ("Cell Lysis Solution"). Мягко смешать, переворачивая пробирки, инкубировать смесь 10 мин при комнатной температуре.

5) Образцы на фильтровальной бумаге: мелко нарезать ножницами фильтровальную бумагу с каплей крови в стерильную микроцентрифужную пробирку. Добавить 300 мкл раствора, лизирующего клетки ("Cell Lysis Solution"), мягко смешать, переворачивая пробирки, инкубировать смесь 10 мин при комнатной температуре.

6) Москиты: гомогенизировать москита (тело самки или его часть) стерильным пестиком в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке, содержащей 300 мкл раствора, лизирующего клетки ("Cell Lysis Solution"). Мягко смешать, переворачивая пробирки.

Центрифугировать при 13000-16000 g 2 мин при комнатной температуре.

Удалить как можно больше супернатанта, не потревожив осадок, некоторый супернатант может оставаться в пробирке. Повторить шаги 1-3.

Встряхните пробирки на аппарате "Вортекс" 10-15 с (частота колебаний 3000/мин), ресуспендируя содержимое пробирок до осветления осадка.

Добавить 100 мкл раствора, лизирующего ядро ("Nuclei Lysis Solution"), в пробирки, содержащие ресуспендированные клетки. Для разрушения лейкоцитов перемешать раствор пипеткой 5-6 раз. Раствор должен стать очень вязким.

7) Добавить 0,5 мкл раствора РНК-аз ("RNase Solution") для лизата ядра и перемешать образец переворачиванием пробирки 2-5 раз. Инкубировать смесь при 37 °С 15 мин, а затем охладить до комнатной температуры.

8) Добавить 33 мкл раствора, преципитирующего белки ("Protein Precipitation Solution"), к нуклеиновому лизату и интенсивно встряхнуть на аппарате "Вортекс" 10-20 с. Центрифугировать при 13000-16000 g 3 мин при комнатной температуре.

9) Перенести супернатант в чистые 1,5 мл микроцентрифужные пробирки, содержащие 100 мкл изопропанола комнатной температуры.

10) Перемешать раствор, аккуратно встряхивая, до появления белых нитеобразных структур ДНК (иногда они могут быть не видны). Центрифугировать при 13000-16000 g 2 мин при комнаткой температуре.

11) Удалить супернатант и добавить к ДНК 100 мкл 70%-го этанола комнатной температуры. Мягко встряхнуть пробирку несколько раз, отмывая осадок ДНК и стенки микроцентрифужной пробирки. Центрифугировать при 13000-16000 g 10 мин при комнатной температуре.

12) Осторожно удалить этанол, не задев ДНК. Перевернуть пробирку на чистую фильтровальную бумагу и высушить на воздухе осадок ДНК (ориентировочно 10-15 мин).

13) В пробирку добавить 20 мкл раствора, регидратирующего ДНК ("DNK Rehydration Solution"). Инкубировать при 65 °С 1 ч, слегка постукивая по пробирке. Также можно регидратировать ДНК, инкубируя раствор всю ночь при комнатной температуре или при 4 °С. ДНК можно использовать сразу или хранить при 2-8 °С. Не более 5 суток.

14) Приготовленный вышеизложенным способом раствор ДНК использовать для постановки ПЦР.