4.2.1. Проведение полимеразной цепной реакции (пцр) Выделение днк

     

Ниже приведены методы выделения ДНК:

1) Фенол-хлороформное выделение ДНК.

2) Выделение ДНК с помощью готовых к использованию коммерческих наборов реагентов.

Допускается применение любого из методов, указанных в настоящих МУК, по выбору исполнителя.

Для повышения точности анализа исследования должны выполняться не менее чем в двух повторах (исследовать от одного образца сразу две пробы).

Метод фенол-хлороформного выделения ДНК

1) Подписать пробирки.

2) Приготовить образец для выделения ДНК:

3) Костный мозг: смешать 1:1 с солевым буфером в стерильной микроцентрифужной пробирке.

4) Биоптат/материал тканей: измельчить ткань (по 10-20 мг) стерильным пестиком или скальпелем в стерильной микроцентрифужной пробирке, смешать с 1-2 мл солевого буфера, можно также добавить протеиназу К, концентрация которой должна составить 200 мг/мл.

5) Образцы свежей крови: 3-10 мл крови центрифугировать при 3000 об./мин, аккуратно удалить супернатант. К осадку добавить равный объем солевого буфера.

6) Образцы на фильтровальной бумаге: мелко нарезать ножницами фильтровальную бумагу с каплей крови в стерильную микроцентрифужную пробирку. Добавить 250 мкл солевого буфера.

7) Соскоб: добавить 100 мкл солевого буфера на материал, который находится на предметном стекле. Перемешать и скарифицировать, используя наконечник пипетки, затем перенести суспензию с поверхности предметного стекла в стерильную микроцентрифужную пробирку. Повторить процедуру, добавив 150 мкл лизирующего буфера. Общий объем лизирующего буфера должен составить 250 мкл.

8) Москиты: гомогенизировать москита (тело самки или его часть) стерильным пестиком в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке, содержащей 250 мкл солевого буфера.

9) Добавить Тритон Х-100, его конечная концентрация должна составить 1%.

10) Добавить протеиназу К, из расчета ее финальной концентрации 100-200 мкг/мл. Инкубировать всю ночь при 60 °С.

11) Добавить смесь фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1, v/v) в равном объеме. Аккуратно встряхнуть в течение 2-3 мин, переворачивая пробирки. Не использовать аппарат "Вортекс".

12) Центрифугировать при 16000 g (максимальная скорость) 10 мин и аккуратно перенести водную (верхнюю) фазу в чистые подписанные 1,5 мл пробирки, остатки утилизировать. Если органическая и водная фазы не достаточно хорошо отделились, следует повторить центрифугирование, увеличив время.

13) Повторить шаги 5 и 6.

14) К водной фазе добавить равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1, v/v), мягко встряхнуть (не использовать аппарат "Вортекс"), центрифугировать 10 мин. Перенести вновь образовавшуюся водную фазу в чистые пробирки и оценить объем.

15) Добавить объема 3 М ацетата натрия (рН 5,2).

16) ПреципитироватьДНК 2,0-2,5 объемами ледяного 96%-го этанола. Аккуратно смешать, переворачивая пробирку (не использовать аппарат "Вортекс"). Инкубировать в морозильной камере - ночь или 1 ч при -70 °С.

17) Центрифугировать 30 мин при 16000 g, аккуратно слить супернатант, не потревожив осадок ДНК, который может быть невидимым.

18) Отмыть осадок ДНК 250 мкл 70%-го охлажденного этанола. Не встряхивать. Центрифугировать при 16000 g 15 мин при температуре 4 °С. Аккуратно удалить супернатант.

19) Оставить пробирку открытой при комнатной температуре до полного высыхания. Также можно использовать вакуумную сушку при 30 °С 10 мин.

20) Внести в каждую пробирку 100 мкл бидистиллированной воды или буфера Трис-ЭДТА. Оставить на 2 ч при комнатной температуре для полного растворения. Хранить при 4 °С - ночь, при -20 °С до использования.

21) Во избежание ингибирования ПЦР остатками фенольных соединений можно очистить выделенную ДНК, используя коммерческий набор подобно Nucleospin Extract 2 в 1 от Macherey-Nagel-Germany или Qiagen PCR purification kit. Очистку производить согласно протоколу производителя. На выходе получится 30 мкл ДНК в буфере комплекта.

22) Приготовленный вышеизложенным способом раствор ДНК использовать для постановки ПЦР.