Метод окрашивания трихромовой краской

Самый простой и быстрый метод для обнаружения структуры ядер и компонентов цитоплазмы амеб.

Необходимые реактивы и оборудование

Предметные стекла обезжиренные, желательно с шлифованным краем, покровные стекла 24 24 мм

Батарея стеклянных банок с притертыми крышками для хранения и использования реактивов при окраске: диаметр горла не менее 24 мм для погружения предметного стекла

Стеклянные палочки

Пинцет пластмассовый

Фильтровальная бумага

Фиксатор Шаудина

Этанол 95%-й

Этанол 70%-й

Этанол абсолютный

Обесцвечивающий раствор уксусной кислоты и спирта

Карбол-ксилол

Раствор йода и спирта

Раствор трихромовой краски

Ксилол

Канадский бальзам или же его быстро высыхающие заменители

Сыворотка любая

Подготовка к исследованию

1) Приготовить тонкий мазок из исследуемого нативного кала.

1а. Если используется осадок после седиментации, каплю осадка смешать с каплей любой сыворотки (для лучшего прилипания) и распределить по стеклу. Мазки готовить быстро, не допуская высыхания препарата.

2) Фиксировать мазок в смеси Шаудина в течение часа (при необходимости мазок может быть оставлен в фиксаторе до 2 дней).

3) С помощью пластмассового пинцета вынуть стекло, слегка обсушить фильтровальной бумагой, но не досуха!

4) Выполнять п.3 после каждого этапа работы.

5) Поместить стекло в 70%-й этанол-1 на 1 мин.

6) Поместить стекло в 70%-й этанол-2 на 1 мин.

Внимание! На этапе работы в п.5 процесс окраски при необходимости может быть приостановлен. После завершения этого этапа процесс прерывать нельзя!

7) Окрасить смесью трихром - 8 мин.

8) Обесцветить мазок раствором уксусной кислоты со спиртом: 2-кратным погружением стекла.

9) Погрузить препарат в 95%-й этанол-1 на 1-2 сек.

10) Погрузить препарат в 95%-й этанол-2 на 2-3 сек.

11) Обезводить в карбол-ксилоле или абсолютном спирте 1 мин.

12) Просветлить препарат в ксилоле - 2-3 мин.

13) Препарат высушить и сразу же нанести каплю (или несколько капель) бальзама.

14) Закрыть покровным стеклом.

15) Микроскопировать препараты следует сначала при большом увеличении: окуляр 10, объектив 40, находя похожие по размеру объекты - на малом увеличении, а затем с водной или масляной иммерсией при увеличении: окуляр 10, объектив 90 или окуляр 10, объектив 100.

Результаты окрашивания

Цитоплазма простейших окрашивается в зеленовато-голубой или зеленый цвет. Ядра и их структуры (кариосомы, периферический хроматин), хроматоидные тельца в цистах амеб, филаменты в цистах жгутиковых окрашиваются в красный или фиолетовый цвет. Гликоген растворяется, и в цитоплазме будут видны пустые участки. Оттенки окрашивания могут варьировать и зависят от точности соблюдения экспозиций, сроков использования и замены реагентов (пропись - прилож.8).

           

Модифицированный метод окрашивания по Цилю-Нильсену

Является методом специфической окраски ооцист кокцидий: криптоспоридиев и изоспор.

Необходимое оборудование и реактивы

Предметные стекла обезжиренные желательно с матированным краем

Стеклянные палочки или шпатели

Стеклянные стаканчики объемом 50 мл или контейнеры для окраски мазков на предметных стеклах в вертикальном положении

Мосты для окраски стекол в горизонтальном положении

Кюветы (эмалированные, нержавеющие или пластиковые)

Любая сыворотка

Краска карбол-фуксин

Метиленовый синий или малахитовый зеленый 5%-й раствор

Раствор серной кислоты 7%-й

Смесь Никифорова

Микроскоп

Подготовка к исследованию

1) Подготовка мазков:

1а) каплю жидких нефиксированных фекалий (кокцидии обычно встречаются в жидком или неоформленном стуле) нанести на обезжиренное предметное стекло и равномерно распределить с помощью стеклянной палочки или краем шлифованного стекла;

1б) осадок после формалин-эфирной седиментации суспендировать, каплю осадка смешать с каплей сыворотки для лучшего прилипания, распределить краем шлифованного стекла.

2) Мазки высушить.

3) Зафиксировать в смеси Никифорова (пропись - прилож.8) - 20-30 мин.

4) Окрашивать карбол-фуксином в вертикальном положении (п.1а) или горизонтальном (п.1б) - 30-40 мин для перекрашивания объектов.

5) Промыть мазки в нескольких сменах водопроводной воды в стаканчике!

6) Дифференцировать в растворе кислоты пока не перестанут отходить облачка краски.

7) Промыть дистиллированной водой.

8) На несколько секунд погрузить в раствор метиленового синего или малахитового зеленого для подкраски фона.

9) Повторить п.7.

10) Высушить мазки.

11) Микроскопировать препараты следует при большом увеличении: окуляр 10, объектив 40, предварительно находя похожие по размеру объекты при малом увеличении.

Результаты окрашивания

Ооцисты криптоспоридий - очень мелкие округлые объекты около 3-5 мкм, окрашиваются в красный цвет, внутри определяются овально вытянутые, полукруглые образования - спорозоиты.

Примечание.

1. Микроскопировать постоянно окрашенные препараты можно только после полного высыхания бальзама или его искусственного заменителя! Если ситуация экстренная, можно препарат осторожно микроскопировать с водной иммерсией!

2. Диагностика крупных, имеющих характерную морфологию изоспор не представляет трудностей и возможна любым из рекомендованных методов.

3. Постоянно окрашенные препараты можно длительно хранить. Для этого нужно часть мазков после промывания провести через спирты возрастающей крепости - 50, 70, 95%, карбол-ксилол, ксилол и заключить в канадский бальзам под покровным стеклом.

4. Прописи растворов, реагентов, применяемых в методах исследований, и способы их приготовления приведены в прилож.8.