- •Методические указания
- •4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы Лабораторная диагностика гельминтозов и протозоозов
- •Область применения
- •Раздел 1. Лабораторная диагностика
- •1.1. Лабораторная диагностика кишечных гельминтозов
- •Отбор проб и условия доставки биологического материала в лабораторию для паразитологического исследования
- •Отбор проб кала
- •1.1.1.2. Микроскопические методы
- •1.1.1.2.1. Метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура
- •1.1.1.2.2. Методы седиментации Метод формалин-эфирной или уксусной седиментации
- •1.1.1.2.3. Модификация метода седиментации с применением одноразовых концентраторов "parasep"
- •1.1.1.2.4. Модификация метода седиментации с применением минисистемы "Real"
- •1.1.1.2.5. Методы исследования кала с применением флотационных растворов
- •1.1.1.3. Методы исследования кала на личинки гельминтов Метод Бермана
- •Метод Бермана в модификации Супряги
- •Метод Харада-Мори в модификации Маруашвили (метод культивирования личинок на фильтровальной бумаге)
- •1.1.1.4. Методы исследования перианальных отпечатков
- •Метод исследования перианального отпечатка с применением липкой ленты по Грэхэму
- •Метод исследования перианального отпечатка с применением стеклянных глазных палочек с клеевым слоем по Рабиновичу
- •1.1.1.6. Методы исследования желчи дуоденального содержимого (желчи, мокроты, лаважной жидкости и мочи)
- •Методы исследования дуоденального содержимого (желчи)
- •Методы исследования желчи с центрифугированием
- •Методы исследования мокроты и лаважной жидкости
- •Методы исследования нативного мазка мокроты
- •Методы исследования нативного мазка мокроты и лаважной жидкости с центрифугированием
- •Методы исследования мочи
- •Метод концентрации мочи
- •Метод фильтрации мочи
- •1.1.2. Диагностические признаки возбудителей гельминтозов
- •1.2.2. Лабораторная диагностика альвеолярного эхинококкоза
- •1.2.3. Метод исследования жизнеспособности паразита in vivo (биопроба)
- •1.3. Лабораторная диагностика трихинеллеза
- •1.3.1. Метод трихинеллоскопии
- •Компрессорная трихинеллоскопия
- •1.3.2. Методы переваривания в искусственном желудочном соке Классический метод переваривания по Березанцеву ю.А.
- •Ускоренный метод переваривания по Владимировой п.А.
- •1.4. Лабораторная диагностика филяриозов
- •1.4.1. Лабораторная диагностика онхоцеркоза
- •Метод исследования необогащенного нативного препарата
- •Метод исследования обогащенного препарата
- •1.4.2. Лабораторная диагностика филяриозов лимфатической системы (вухериоза и бругиоза)
- •Метод исследования нативного мазка крови из пальца
- •Микрокапиллярный метод обнаружения живых микрофилярий по Супряге
- •Методы исследования венозной крови
- •Метод концентрации микрофилярий в осадке по Кнотту
- •Метод мембранной фильтрации микрофилярий по Беллу, модифицированный Супрягой и Андреенковым
- •Микроскопическое исследование препаратов крови
- •1.4.3. Методы диагностики подкожного дирофиляриоза
- •1.4.4. Диагностика сердечно-легочного дирофиляриоза
- •Раздел 2. Лабораторная диагностика протозоозов
- •2.1. Лабораторная диагностика протозойных инфекций кишечника
- •2.1.1. Микроскопические методы исследования кала на простейшие кишечника
- •Основные методы исследования кала на простейшие кишечника
- •2.1.2. Специальные методы исследования кала на простейшие кишечника
- •Метод приготовления влажного мазка нативного кала с физиологическим раствором, растворами Люголя и метиленового синего
- •Методы приготовления постоянных окрашенных препаратов кала
- •Метод окрашивания трихромовой краской
- •Модифицированный метод окрашивания по Цилю-Нильсену
- •2.1.3. Диагностические признаки трофозоитов и цист кишечных простейших
- •2.1.4. Экспресс-тест для определения антигенов лямблий и криптоспоридий в пробах кала
- •2.2. Лабораторная диагностика трипаносомозов
- •2.2.1. Метод исследования нативных препаратов крови
- •Метод исследования толстой капли
- •2.2.2. Метод исследования неокрашенных мазков из лимфатических узлов
- •2.2.3. Метод исследования неокрашенных мазков из спинно-мозговой жидкости
- •2.2.4. Диагностические признаки возбудителей трипаносомоза
- •2.3. Лабораторная диагностика лейшманиозов
- •Отбор проб биологического материала на наличие возбудителей кожного лейшманиоза
- •Отбор проб биологического материала на наличие возбудителей висцерального лейшманиоза
- •2.3.1. Микроскопические методы исследований на лейшманиозы
- •2.3.2. Посев возбудителей лейшманиозов на питательную среду с последующим культивированием
- •Приготовление питательной среды
- •2.3.3. Диагностические признаки возбудителей лейшманиозов
- •Раздел 3. Автоматизированные системы микроскопирования с программным модулем "Паразитология"
- •Раздел 4. Лабораторная диагностика паразитозов методом полимеразной цепной реакции (пцр-диагностика) Введение
- •Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
- •4.1. Подготовка к анализу
- •4.1.1. Проведение анализа. Выделение днк. Метод выделения днк с помощью набора Diatom dna Prep 100/200
- •Амплификация
- •4.1.2. Проведение электрофореза в агарозном геле
- •4.2. Полимеразная цепная реакция и рестрикция (пцр) на идентификацию возбудителей лейшманиозов Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы для пцр-исследования и рестрикции
- •4.2.1. Проведение полимеразной цепной реакции (пцр) Выделение днк
- •4.2.2. Выделение днк коммерческим набором*
- •Амплификация
- •Реакционная смесь для пцр
- •Условия амплификации
- •Проведение электрофореза в агарозном геле
- •Рестрикционный анализ
- •Реакционная смесь для рестрикции
- •Размеры фрагментов рестрикции
- •Информативность микроскопических методов исследований
- •Морфологическое строение яиц гельминтов
- •Взрослые особи возбудителей нематодозов
- •Морфологическое строение зрелых члеников цестод
- •Морфологическое строение личинок нематод
- •Морфологическое строение кишечных простейших
- •Морфологическое строение микрофилярий
- •Диагностические признаки взрослых дирофилярий
- •Реагенты, растворы и методы их приготовления
- •I. Химические консерванты, применяемые для консервации и хранения половозрелых гельминтов или их фрагментов, яиц и личинок гельминтов
- •II. Обесцвечивающий раствор спиртовой уксусной кислоты (n 1):
- •III. Раствор буферного метиленового синего (n 2)
- •IV. Буферный раствор для окраски по Романовскому-Гимза
- •V. Раствор глицерина с малахитовым зеленым или раствор глицерина с метиленовым синим:
- •VI. Спиртовый раствор йода:
- •VII. Раствор Люголя
- •VIII. Фосфатный раствор метиленового синего:
- •XIV. Раствор лимонно-кислого натрия 2%-й:
- •XV. Раствор краски трихром:
- •XVI. Приготовление раствора Като:
- •XVII. Пропись клея для исследования перианальных соскобов на энтеробиоз по методу Рабиновича:
Метод мембранной фильтрации микрофилярий по Беллу, модифицированный Супрягой и Андреенковым
Необходимые реактивы и оборудование
Раствор уксусной кислоты 1%-й или раствор формалина 2%-й
Обезжиренные центрифужные пробирки
Обезжиренные предметные стекла
Дистиллированная вода
Мембранные фильтры с диаметром пор 0,8-5,0 мкм
Краска Романовского-Гимза
Иммерсионное масло
Установка для вакуумного фильтрования
Фильтродержатель
Центрифуга
Микроскоп, стереомикроскоп
Специальное оборудование: аппарат для фильтрации крови состоит из воронки-фильтродержателя с прямоугольным отверстием размером меньше фильтра. Для ускорения фильтрации используют вакуум.
Подготовка к исследованию
1) К 1 мл крови в центрифужной пробирке добавляют 9 мл 1-3%-го раствора уксусной кислоты или 2%-го раствора формалина.
2) Фильтруют гемолизированную кровь и смывы 2-3 раза с пробирки на мембранные фильтры под вакуумом.
3) Полученный осадок на фильтре под вакуумом фиксируют крутым кипятком в объеме 20-30 мл и фильтры вынимают из фильтродержателя.
4) Фильтры высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимзе.
5) Контроль качества окраски личинок в препаратах проводится по степени окрашивания ядер лимфоцитов.
6) Окрашенные фильтры тщательно споласкивают водой и высушивают.
7) Микроскопирование фильтров проводят на предметном стекле, предварительно покрыв всю поверхность фильтра тонким слоем иммерсионного масла, при малом увеличении с применением препаратоводителя.
8) Идентификацию окрашенных микрофилярий проводят под иммерсией ( 90), их количество учитывают отдельно по видам.
Примечание. Вместо специального аппарата можно использовать шприц с фильтродержателем: 25-миллиметровый держатель Суини с 25-миллиметровой мембраной "Миллипор" размером пор 5 мкм, который поддерживается снизу мягкой прокладкой.
Микрофилярии на окрашенных фильтрах, пропитанных иммерсионным маслом, сохраняют морфологические признаки в течение 5 лет и более.
Микроскопическое исследование препаратов крови
Нативные неокрашенные препараты микроскопируют с помощью любого стереоскопического бинокулярного микроскопа при увеличении: окуляр 12,5; объектив 2, 4, 6 последовательно.
Идентификация личинок
Идентификацию личинок на окрашенных препаратах проводят на любом световом микроскопе при увеличении окуляра 10, объектива 10, 20, 40.
Микрофилярии идентифицируют по морфологическим признакам:
наличие чехлика W. bancrofti, В. malayi, Loa loa - чехлик выступает за головной и хвостовой концы тела;
отсутствие чехлика М. perstans, M. ozzardi;
расположение окрашенных ядер соматических клеток внутри тела - на хвостовом конце в виде ядерной колонки (диагностический признак);
W. bancrofti - ядерная колонка заканчивается несколькими удлиненными ядрами, не доходящими до вершины хвостового конца;
В. malayi - ядерная колонка не доходит до хвостового конца. Отдельно от ядерной колонки и друг от друга расположены два ядра, одно - субтерминально на самой хвостовой вершине;
Loa loa - одноядерная колонка доходит до вершины хвостового конца;
М. perstans - ядерная колонка компактная по всей длине тела, форма хвостового конца - пальцевидная;
М. ozzardi - ядерная колонка заполняет хвостовой конец, форма хвостового конца - суженная;
ядра соматических клеток у всех видов микрофилярий на головном отделе отсутствуют (прилож.6).