5. Методы селекции микроорганизмов и генная инженерия.

План

1. Селекция спонтанных и индуцированных мутантов бактерий

2. Селекция рекомбинантных микроорганизмов.

3. Генная инженерия – как биотехнологический метод получения рекомбинантных микроорганизмов.

5.1. Введение

В предыдущих главах лекции с позиции современной генетики рассмотрены принципы получения производственных штаммов микроорганизмов. С позиции адаптационной изменчивости раскрыт процесс формирования микробных фенотипов с совокупностью наблюдаемых признаков. Затем были представлены основные механизмы возникновения мутаций и рекомбинаций генетического материала, которые могут проявиться как в естественных условиях (без участия человека), так и искусственным индуцированием.

Однако воздействие мутагеном или осуществление рекомбинации генома бактериальной клетки являются только начальным этапом селекционной работы микробиолога. Основная ее часть – это отбор из популяции (бактериальной культуры) клеток с измененным генотипом по определенным (целевым) признакам и микробиологическая проверка генетической закрепленности новых свойств. Завершающий этап селекционной работы сводится к опытно-производственной и производственной проверке нового штамма микроорганизма в конкретном биотехнологическом процессе биопредприятия.

Рассматривая селекционно-бактериологическую работу с биотехнологических позиций, микробиологу и биотехнологу необходимо знать следующие методы селекции:

1. Поиск полезных, ценных штаммов микроорганизмов, появляющихся в природе самостоятельно (спонтанно) путем естественного отбора.

Сущность этого метода заключается в получении такой формы микроорганизма, которая оказывается в некоторых условиях среды более приспособленной, чем исходная. Например, растет на новой питательной среде, более устойчива к вредным факторам, приспосабливается к росту при измененной температуре культивирования и т.п.

Если отбираемый признак биологически полезен для микроорганизма, тогда самое простое – создать именно такие условия для его культивирования и предоставить естественному отбору «право» отобрать естественно возникающую мутацию, как более приспособленную форму. При этом более приспособленная к данным условиям культивирования форма мутанта вытесняет исходную менее приспособленную форму.

2. Искусственый отбор естественно возникающих форм.

Если отбираемый признак не является биологически полезным для микроорганизма и поэтому невозможно создать условия, автоматически отбирающие нужные измененные варианты, приходится прибегать к искусственному отбору, произведя при этом проверку свойств отдельных клонов.

Клон – это культура бактериальных клеток, полученная в результате размножения одной единственной клетки и вследствие этого, состоящая из наследственно однородных клеток.

На практике клонирование осуществляют путем проверки свойств бактерий отдельно растущих изолированных колоний, получаемых на плотных питательных средах.

Искусственный отбор на основе естественно возникающей изменчивости у микроорганизмов приводит к положительным результатам лишь в тех немногочисленных случаях, когда селекционер имеет дело с явно гетерогенной, т.е. неоднородной по интересующему его признаку, популяцией.

3. Искусственный отбор с применением мутагенных факторов.

Низкая эффективность, а часто безуспешность отбора без применения мутагенов, заставила обратиться к их использованию в селекции.

Принципы использования мутагенов в селекции нами уже раскрыты. Они заключаются в следующем: известно, во-первых, что мутагены вызывают появление мутаций, которые в естественных условиях происходят очень редко. Во-вторых, индуцированная изменчивость носит веерообразный характер, т.е. возникает самые разнообразные мутации, а при учете мутаций, касающихся желательного признака, наблюдаются отклонения как в нужном, так и в противоположном направлении по сравнению с исходной формой.

Отсюда следует, что основная задача при использовании мутагена увеличение генотипической неоднородности исходного материала, что облегчает последующий отбор нужных форм.

Поясним это на таком примере. При естественном возникновении частота мутаций имеет порядок 1*10-6 и ниже. Для обнаружения этой клетки-мутанта потребовалось бы испытать миллион образцов (клонов), что практически невозможно. Если же мутагенное воздействие увеличивает частоту возникновения мутаций, например, в тысячу раз, то достаточной оказывается выборка из 1000 клонов. Задача испытания такого числа образцов уже вполне реальна.

Задача еще более упрощается, если имеется возможность использования селективных сред, на которых будет расти только мутант, имеющий целевой (искомый) признак.

В практической селекции не ограничивается однократным воздействием мутагена и отбором лучшего штамма среди потомства отобранных клеток. Отобранный лучший штамм становится объектом повторного отбора после нового применения мутагена. Затем опять отбирается лучший клон и его клетки вновь обрабатываются мутагеном с послдующим отбором. Такой многократный отбор приводит к ступенчатому повышению продуктивности или усилению желательного признака на каждом этапе селекции. Эту систему обычно называют ступенчатой селекцией. Ступенчатый отбор, например, дал замечательные результаты в селекции продуцентов антибиотиков, где с его помощью удалось повысить продуктивность штаммов в десятки и сотни раз.

Следует отметить, что разные виды микроорганизмов могут требовать различных мутагенных факторов, их доз и условий для эффективного мутагенеза.

4.Селекция бактериальных клеток путем получения генетических рекомбинантов.

С данной группой методов мы познакомились подробно, рассматривая конъюгацию, трансдукцию и трансформацию как способы рекомбинации и получения рекомбинантных клеток. До первой половины 70х гг. классические способы получения мутантов и рекомбинантов в селекции бактерий исчерпали арсенал селекционных приемов.

Однако бурное развитие молекулярной биологии и генетики в это время привело к возникновению новой экспериментальной технологии, открывшей перед селекционерами новые уникальные возможности. Эта технология получила название генетической инженерии (генная инженерия) или работа с «рекомбинантной ДНК». Все три названия равнозначны. В России большее распространение имеют первые два названия, на Западе – последнее. Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in vitro, т.е. в «пробирке», с последующим введением новых («рекомбинантных») генетических структур в живую клетку.

Обычные методы обмена генетической информацией, т.е. генетические рекомбинации позволяют провести обмен генами внутри одного вида или близкородственных видов, тогда как генетическая инженерия, в принципе открывает возможность для перемещения генов в пределах всех живых организмов. Это обусловлено тем, что с химической точки зрения, как мы уже говорили, ДНК всех организмов однотипна.

Техника генной инженерии впервые позволила получать индивидуальные фрагменты ДНК в достаточных количествах из геномов любой степени сложности и открыла путь к выяснению строения генов высших организмов, в т.ч. и человека.

Главным общенаучным итогом развития современной биологии явилось выявление удивительной универсальности жизни на молекулярном уровне. Действительно, во всех живых системах носителем генетической информации являются нуклеиновые кислоты (ДНК или реже РНК), причем эта информация записана на языке универсального генетического кода. Молекула АТФ является общим переносчиком энергии во всех живых клетках. Двадцать аминокислот составляют белки всех живых организмов и т.д. Для нас важно то, что воспроизведение макромолекул в живых системах также подчиняется общим принципам.

Так, для процесса удвоения ДНК (репликации), синтеза и-РНК (транскрипции) и синтеза белка (трансляции) важным являются последовательности нуклеотидов матрицы в районе начала и окончания процессов и малое значение имеет последовательность, заключенная между этими специфическими последовательностями (или сайтами). Именно это позволяет создать такие гибридные молекулы ДНК, которые будут стабильно реплицироваться (удваиваться) после введения их в реципиентную клетку, и даже такие, в которых чужеродная информация будет управлять синтезом чужеродного белка.

Схематично генно-инжененрная технология состоит из следующих этапов:

1. Получение фрагмента ДНК, кодирующего нужный нам признак, или смеси фрагментов;

2. Конструирование «в пробирке» (in vitro) рекомбинантных молекул ДНК, состоящих из фрагментов, полученных на первом этапе и небольших самостоятельно реплицирующихся в клетке реципиенте структур (плазмид, фагов, вирусов), носящих название векторов;

3. Введение рекомбинантных молекул ДНК в клетку реципиент;

4. Отбор клонов, несущих нужную рекомбинантную молекулу.

Технология каждого этапа генной инженерии сводится к следующим приемам.

А. Источники и способы получения ДНК для клонирования

Существуют три различных источника молекул ДНК, используемых в генной инженерии. Первым, важнейшим из них, являются фрагменты генетического материала различных организмов. Вторым источником могут быть двунитевые ДНК, полученные на основе однонитевой ДНК, комплиментарной м-РНК эукариотических организмов. То есть получают м-РНК эукариота и на ней синтезируют первую цепь ДНК. Затем м-РНК удаляют, а на оставшейся нити ДНК синтезируют ее вторую нить. Таким образом осуществляется синтез ДНК, аналогичной фрагменту ДНК клетки эукариота. Этот процесс часто именуют обратной транскрипцией м-РНК (экзоны, кодирующие части гена эукариот, интроны – некодирующие).

Третий источник молекул ДНК – химико-ферментативный синтез генов. Чтобы синтезировать ген, нужна предварительная информация о его нуклеотидных последовательностях, или об аминокислотных последовательностях в соответствующем белке. Примером химико-ферментативного синтеза генов может служить синтез гена лейкоцитарного интерферона человека, осуществленный в нашей стране в 1982-1984 гг.

В настоящее время наибольшее значение имеет первый источник ДНК из различных организмов. Для получения коротких фрагментов цельной молекулы ДНК или слишком длинных ее отрезков раньше применяли гидродинамическое дробление, проще, многократно пропуская раствор ДНК через иглу шприца. При этом разрывы происходят в произвольных точках молекулы ДНК, и образуется смесь самых разных фрагментов, в т.ч. близких по величине среднему гену. Из них в генной инженерии создается банк генов, или так называемая клонотека. Однако, соединить такие фрагменты с молекулами-векторами сложно. Поэтому гидродинамический способ фрагментации сейчас используют редко.

Огромное значение в становлении генной инженерии сыграло открытие специального класса ферментов – рестриктаз. Используя способность этих ферментов «узнавать» строго определенные участки на молекуле ДНК и разрывать ее в этих местах, удалось намного упростить процесс получения необходимых фрагментов ДНК для клонирования.

В настоящее время из различных микроорганизмов выделено более 500 рестрактаз. Особую ценность для генной инженерии представляют рестриктазы, под действием которых образуются фрагменты. ДНК с т.н. «липкими» концами. Такие фрагменты легко соединяются с векторными молекулами и успешно используются при конструировании рекомбинантных молекул.

Б. Способы конструирования рекомбинантной ДНК in vitro.

Прежде всего следует дать ответ на вопрос, каким образом осуществляют воссоединение фрагментов ДНК с векторными молекулами (векторами). И что такое вектор?

Под вектором понимают небольшую молекулу ДНК, способную к самостоятельной репликации в определенном микроорганизме. Чаще всего это плазмиды или фаги. Вначале вектор готовят к воссоединению с фрагментом ДНК. Для этого его обрабатывают рестриктазой с тем, чтобы из замкнутой кольцевой формы получить нитевидную с «липкими» концами на периферии отрезка. Лишь после этого возможен «отжиг», т.е. образование водородных связей между нуклеотидами вектора и фрагментами донорной ДНК. Окончательное воссоединение фрагментов ДНК в кольцевую рекомбинантную ДНК осуществляют путем обработки их ферментом ДНК-лигазой.

Наличие «липких» однонитевых концов у фрагментов ДНК не является обязательным условием для их воссоединения ДНК-лигазой. Она способна соединять фрагменты и с «тупыми» двунитевыми концами, однако для этого требуется во много раз большее количество фрагмента.

К недостаткам этого способа воссоединения ДНК относится возможность образования при отжиге и лигировании не только гибридных молекул, но и исходных векторов. Для устранения этого недостатка ДНК вектора обрабатывают несколькими рестриктазами, дробя ее на много линейных отрезков (уменьшается возможность самосборки исходного вектора). Но более эффективным способом все же является обработка вектора щелочной фосфотазой, которая с концевых участков отщепляет фосфатные группы и самовоссоединение векторной ДНК становится невозможным. Воссоединение возможно лишь в присутствии донорной ДНК с неповрежденными фосфатными группами. Есть и другие способы воссоединения фрагментов ДНК, но они более трудоемки и применяются реже.

В. Введение рекомбинантных молекул ДНК в клетку реципиент.

Если в качестве вектора использовали плазмиды, то рекомбинантную ДНК вводят путем трансформации. В трансформации участвуют, примерно одна из 1-10 тыс. молекул ДНК. Однако низкая эффективность трансформации не является препятствием для применения этого способа и последующего клонирования с целью обнаружения в популяции клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Если в качестве вектора использовали ДНК фагов, то после упаковки рекомбинантной ДНК в капсид фага ее можно вводить в клетку способом инфицирования, т.е. заражения клеток фагами, несущими рекомбинантную ДНК. Таким способом удается ввести в клетку реципиента, примерно, каждую десятую молекулу ДНК, что намного эффективнее трансформации.

Важнейшим этапом в конструировании рекомбинантных клеток является постановка полученного структурного гена под контроль регуляторных элементов клетки хозяина или того микроорганизма, в который этот ген будет перенесен.

Чтобы понять способы решения этой задачи необходимо рассмотреть механизмы репликации, транскрипции и трансляции в бактериальной клетке.

Фактически речь идет о решении задачи по обеспечению синтеза чужеродных белков в клетке реципиенте. В генной инженерии это получило название экспрессии чужеродных генов.

Для процессов транскрипции и трансляции важными являются последовательности нуклеотидов матрицы в районе начала и окончания этих процессов. Такие специфические участки названы сайтами. Последовательность нуклеотидов между сайтами начала и окончания процесса не оказывает влияния на сам процесс. Перед каждым реплицирующимся геном находится сайт начала транскрипции (синтеза м-РНК), который назвали промотором и сайт начала трансляции м-РНК на рибосоме (т.е. сайт начала синтеза молекул белка с м-РНК на рибосоме), который обозначен SD-областью. В конце гена находится сайт окончания транскрипции и трансляции, который назвали терминатором. Процесс транскрипции начинается с того, что фермент РНК распознает на ДНК промотор, соединяется с ним, расплетает в этом месте двойную спираль ДНК и приступает к синтезу м-РНК. Дойдя до терминатора синтез с-РНК прекращается. Затем рибосома распознает на м-РНК, SD-область и соединившись с ней начинает синтез белка. Дойдя до терминатора, синтез белка прекращается.

Промоторы работают с разной эффективностью, т.е. при одинаковых условиях с одним промоторов (сильных) синтез м-РНК начинается часто, с других (слабых) – редко.

Поэтому, первым условием экспрессии чужеродного гена в микроорганизмах должно быть наличие перед этим геном сильного промотора, распознаваемого РНК-полимеразой клетки-хозяина, а вторым условием - наличие перед геном чужеродного белка оптимального сайта начала трансляции м-РНК.

Существует три способа конструирования, обеспечивающие трансляцию чужеродной генетической информации в бактериальных клетках.

Первый способ – внедрение чужеродного гена лишенного собственных регуляторных областей внутрь хорошо синтезируемого бактериального гена. В этом случае бактериальная клетка использует регуляторные элементы собственного гена. Единственное условие такого способа конструирования – встройка чужеродного гена должна быть осуществлена в правильной рамке считывания. Недостаток метода – трудность последующего расщепления гибридного белка и выделения конечного продукта.

Второй способ. Прямая экспрессия. При этом способе встройка чужеродного гена производится в области начала трансляции с образованием гибридного участка SD (участок SD бактериального гена + участок SD чужеродного гена). Такой способ позволяет получать практически естественный чужеродный белок. Недостаток метода в том, что гибридный SD участок приходится конструировать в каждом конкретном случае заново.

Третий способ, лишенный недостатков двух первых, заключается в следующем. Чужеродный ген встраивается в конце бактериального гена таким образом, что SD область чужеродного гена перекрывается на один нуклеотид с терминатором бактериального гена. В этом случае рибосомы, начавшие синтез бактериального гена, доходят до терминатора, но не покидают при этом м-РНК, а приступают к трансляции чужеродного белка. При этом способе используется природный феномен, когда терминатор одного гена в тоже время является промотором для другого, следующего за ним.

При создании промышленных штаммов микроорганизмов во многих случаях необходимо добиваться на максимальной экспрессии генов, а ее оптимизации. Очень высокий синтез некоторых белков часто летален для клетки. Для биопромышленного производства важно получить максимальный выход продукта с единицы объема ферментера в единицу времени, а не максимальный синтез белка в пересчете на клетку. Так, высокий синтез некоторых белков может резко снизить жизнеспособность клеток и в конечном счете привести к снижению выхода продукции в промышленной ферментации. Получение белков, токсичных для микроорганизмов, часто выгодно проводить с регулируемым промотором в две стадии. В первой стадии при молчащем промоторе, а следовательно, при отсутствии синтеза чужеродного токсичного белка. Осуществляется рост биомассы, а затем путем изменения условий культивирования (изменение температуры, pH и др.) включается промотор. В этих условиях все клетки в аппарате одновременно начинают синтезировать продукт, и их дальнейшая судьба нас не волнует.

Заключение. Генетика и селекция прокариот – далеко не исследованные области знаний. Но вместе с тем, современный молекулярно-биологический уровень знаний об особенностях строения и функционирования наследственного аппарата у микроорганизмов позволяет целенаправленно изменять генотипические задатки бактериальных клеток и их фенотипические признаки. Материалы лекции в основном направлены на изложение теоретических вопросов, без знания которых биотехнологические процессы становятся трудно контролируемыми, следовательно, и малоэффективными. Любая биотехнологическая система может оптимально функционировать, если работающие с ней специалисты знают и владеют методами селекционно-микробиологических исследований и производственного контроля.

31