4. Принципы и техника получения рекомбинантных штаммов микроорганизмов.
План:
4.1. Горизонтальный путь переноса генетической информации
4.2. Конъюгация
4.3. Трансдукция
4.4 Трансформация
4.1. Горизонтальный путь переноса генетической информации
В предыдущих частях лекции раскрыты основные механизмы, направленные на поддержание стабильности функционирования генетического аппарата микроорганизмов. При передаче генетической информации от одного поколения к другому, т.е. по вертикали.
Стабильность генетического аппарата не абсолютна и при всей надежности – изменения являются его неотъемлемыми свойствами. Более того, для всех прокариот характерна большая способность к генетическим изменениям, являющимися результатом мутаций. Новые наследственные признаки, как было показано, возникают в генофонде (генетический состав популяции) в результате генных мутаций.
Параллельно с генными мутациями существует горизонтальный путь переноса генов (фрагмента ДНК) между бактериальными клетками и возникновение на базе этого особей СС рекомбинантным геном (генотипом). В результате рекомбинаций получается измененное потомство, наследующее частично качества родительских особей. Рекомбинация, каак одна из разновидностей генетической (наследственной) изменчивости, у микроорганизмов, осуществляется тремя способами: конъюгацией, трансформацией и трансдукцией. В результате этих трех процессов ДНК переносится из бактерии донора в бактерию реципиент. Эти процессы отличаются друг от друга только способом транспортировки ДНК. После переноса ДНК в клетке-реципиенте происходит рекомбинация, при этом ДНК донора встраивается в ДНК бактерии-реципиента (рис.1). Клетку, в которой произошла рекомбинация, называют рекомбинантом.
Рис 1. Общая гомологичная рекомбинация
4.2. Конъюгация
Перенос генетического материала путем прямого котнакта между двумя клетками называется конъюгацией. Уже давно на основании морфологических данных предполагали, что у бактерий может происходить своего рода «спаривание».
Ледерберг и Татум (1946) в своих опытах использовали мутантные E.coli, отличающиеся по ряду признаков (потребность в различных аминокислотах). И при совместном культивировании этих мутантов выяснилось, что из 109 вновь полученных клеток примерно 100 обладали свойствами обоих родительских мутантов. Таким образом, впервые была показана возможность обмена генетической информацией между бактериальными клетками.
Следует отметить, что передача ДНК при конъюгации возможна лишь в одном направлении – от клетки-донора к клетке-реципиенту, а не наоборот и далеко не все клетки могут быть донорами. Способность клетки выступать в качестве донора связана с наличием в ней полового фактора – F (от fertility – плодовитость). Фактор F представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК. В качестве внехромосомного автономно реплицируемого элемента ДНК ее следует отнести к плазмидам. Эта молекула содержит гены, ответственные за процесс конъюгации и гены, детерминирующие особые структуры клеточной поверхности – половые волоски, или F-пили, необходимые для конъюгации (взаимное узнавание). При конъюгации, т.е. при прямом контакте между клетками, частота передачи фактора F близка к 100%. Таким образом, клетки реципиента в результате конъюгации превращаются в потенциальных доноров. При этом хромосомные признаки еще не передаются, поскольку рекомбинанты наследуют большинство своих признаков от реципиента, а от донора получают только фрагменты генома в виде плазмиды.
Плазмиды вообще, в т.ч. и плазмиды F, не являются обязательными компонентами бактериальных клеток и обнаруживаются лишь у части из них. Плазмиды придают клетке дополнительные признаки, необязательные для ее жизнедеятельности. Они могут кодировать устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды), к ионам тяжелых металлов, определять синтез токсинов, бактериоцидов, антибиотиков, влиять на метаболизм клетки и т.д.
Большинство плазмид обладают самостоятельной способностью передаваться от донорской клетки к реципиентной при конъюгации. Такие плазмиды называются конъюгативными. Плазмиды же, передающиеся только с участием конъюгативных плазмид, определяются как неконъюгативные (трансмиссивные).
Плазмиды чаще находятся в цитоплазме в свободном состоянии, и лишь некоторые из них могут соединяться с ДНК хромосомы. Такие плазмиды называются эписомами. В силу этого в популяции F лишь немногие клетки способны быть донорами хромосомной ДНК. Эписомы определяют важнейшие свойства конъюгативных плазмид по переносу в реципиентную клетку участков хромосомы. Использование клонов таких клеток – доноров в экспириментах со скрещиванием примерно в тысячу раз эффективнее в селекции рекомбинантов, чем при использовании обычных клеток F.
Конъюгация все чаще применяется при конструировании промышленных штаммов микроорганизмов. Таким способом сравнительно легко получают генетические рекомбинанты с заранее заданными свойствами. Для этого разработан способ искусственного создания гибридных плазмид, что позволяет объединить различные плазмиды в одной бактериальной клетке.
Плазмиды используют в генетической инженерии в качестве вектора для основного фрагмента хромосомной ДНК. Более того, используя феномен амплификации генов, удается увеличить число копий определенного гена в микробной клетке. Применяемый технический прием связан с увеличением числа плазмид на клетку. В норме они присутствуют в 1-30 копиях на клетку и содержат 2-250 генов, а удается добиться до 3000 копий плазмидных генов на клетку и тем самым обеспечить сверхсинтез определенного метаболита (антибиотика и др.).
Ярким примером получения многоплазмидной рекомбинантной бактерии является Ps.putida, способная энергично расти, усваивая неочищенную нефть, поскольку она утилизирует гораздо больше углеводородов, чем любая бактерия с одной плазмидой. Конъюгация использована при конструировании штаммов-продуцентов треонина, интерферона и многих других биологически активных веществ.