3.2. Спонтанные и индуцированные мутации

Мутации по своему происхождению могут быть спонтанными и индуцированными.

В популяции бактерий без всякого экспериментального вмешательства регулярно возникают мутации. Поскольку они возникают под влиянием неизвестных причин – их называют спонтанными. Клетки, же в которых они возникли, называют спонтанными мутантами.

Понятие спонтанности не равнозначно беспричинности, - вернее говорить о неконтролируемых мутациях. В природе в роли мутагенных факторов могут выступать многие химические, физические и биологические агенты. Определенная же часть спонтанных мутаций обусловлена свойствами самих самовоспроизводящихся структур с присущей им способностью в исключительных случаях к нетождественному воспроизведению “ошибки” при репликации ДНК/.

Численная доля мутантов в клеточной популяции для разных признаков различна и варьирует в пределах от . Она зависит от частоты возникновения мутаций, условий среды, возраста клеточной культуры и многих других факторов.

Обрабатывая микробные клетки определенными мутантными веществами можно изменить частоту мутаций. Наблюдаемое увеличение частоты мутаций в ответ на контролируемый в эксперименте фактор внешней среды доказывает, что данный фактор является мутагенным. В этом случае говорится об индукции мутации, а получение при этом клетки называют индуцированными мутантами.

В настоящее время в качестве мутантов чаще применяют: включение аналогов оснований /бромурацил и 2-аминопурин - это антиметаболиты/, химические изменение оснований /азотная кислота, нитриты, гидроксиламин/, алкинирующие агенты /этил - и метилметансульфонат, диметил – и диэтилсульфат, этиленимин, иприт/, акридиновые красители /профлавин и др./, ультрафиолетовые лучи и ионизирующее излучение.

Под действием мутагена может попасть любая структура генотипа. Поэтому их воздействие не может быть строго направленным. Характер мутаций зависит в первую очередь от структуры и функции затронутых генов. Вследствие этого как спонтанные, так и индуцированные мутации в одинаковой степени являются разнонаправленными, т.е. проявляется в виде “веера” мутаций.

3.3. Фенотипическое проявление и оценка мутаций

Всякая мутация – это внесение нового элемента в отрегулированную систему генотипа. Поэтому результат (эффект) мутации может оказаться как положительным (улучшающий генотип), так и отрицательным (нарушающим его слаженность, жизнеспособность) для данного микроорганизма.

В селекционной работе понятие «положительный и отрицательный эффект мутации» весьма относительны. Так, приобретение бактерией в результате мутации устойчивости к лекарственным препаратам является «положительным» для возбудителей инфекции (способ сохранения вида), но этот же эффект с позиции лечащего врача и пациента рассматривается как отрицательное явление. Снижение вирулентности или полная ее утрата – отрицательное явление для микроба – паразита (патогена), ибо снижается шанс победы в борьбе с макроорганизмом, но оно же «положительно» для микробиолога и инфекциониста, которые получают в таком случае возможность использовать мутант в качестве вакцинного штамма (вакцина:ТС-177 против сальмонеллеза, АУФ против листериоза).

Поэтому оценочные характеристики мутантным штаммам микроорганизмов следует давать по результатам целевой направленности селекционной работы и возможностям прикладного использования в биопроизводстве.

Мутация реализуется по тем же законам как и любая другая генетическая информация. Но судьба мутаций различна. Некоторые мутации не влияют на признаки микробной клетки. Оставаясь «молчащими» они не проявляются в процессе трансляции и не приводят к изменению аминокислотной последовательности синтезируемого белка.

В других случаях они происходят в дали от активного центра фермента и не могут сказаться на его функции.

Если же в центре – функция фермента резко меняется, диапазон изменений функциональной активности ферментов велик – от незначительного понижения активности до полной потери, что нередко приводит к гибели микроорганизма.

Для проявления мутации необходимо, по крайней мере, один цикл репликаций ДНК с измененной нуклеотидной последовательностью (премутация). Если исходное изменение закрепляется после репликации в дочерней молекуле ДНК, то оно становится стабильным, а отсюда наследственным.

Важной характеристикой мутантов является их способность к реверсии, т.е. обратному мутированию к исходному фенотипу. Мутанты, появившиеся в результате реверсии, называются ревертантами. При истинных обратных мутациях в ДНК восстанавливается исходная последовательность оснований. Так обычно ревертируют точечные мутации, когда одна пара оснований заменяется другой (например, вместо АТ может быть ГЦ, или наоборот), реже – в случае выпадания или вставки одного или нескольких нуклеотидов.

Кроме того, реверсия может произойти в результате супрессорных мутаций. При внутригенной супрессии вторая мутация возникает в том же гене, что и первая и приводит к более или менее полному восстановлению функций белка. При внегенной супрессии вторая мутация затрагивает другой ген (ген-супрессор). Восстановленная активность поврежденного белка при этом обычно не превышает 10 % от исходного уровня.

Штаммы-ревертанты и супрессорные ревертанты микроорганизмов с пониженной вирулентностью обычно используют в качестве вакцинных штаммов в биопромышленности (например, супрессорный ревертант S. choleroe suis).

Для выражения мутации в фенотипе необходимо прохождение этапов транскрипции и трансляции. Иногда для проявления мутационного измененного признака, т.е. фенотипического проявления, необходимо несколько клеточных делений, с тем, чтобы иссякли в дочернях клетках мутируемые признаки (ферменты, витамины и т.д.)

На проявление мутантных признаков также влияет количество копий хромосомы, содержащихся в прокариотной клетке. Все прокариоты гаплоидны, имеют набор генов, локализованных в одной хромосоме.

В определенных условиях в клетке можно обнаружить несколько копий одной хромосомы. Если в такой клетке произошла мутация, приведшая к нарушению синтеза определенного метаболита, то она сразу (после одного цикла репликации, транскрипции, трансляции) также не проявится поскольку синтез необходимого клетке метаболита будет осуществляться неповрежденным генами остальных копий хромосом.

Для фенотипического выражения мутантного гена необходимо, чтобы он содержался в клетке в «чистом виде», т.е. клетка имела одну хромосому с мутантным геном, или чтобы все хромосомы в клетке имели одинаковый генотип. Это происходит через несколько делений, что показано на рис.1.

Таким образом, из приведенного материала можно сделать заключение, что новый мутантный генотип проявится лишь тогда, когда измененный ген начнет функционировать. Этапы микробиологической и биотехнологической работы необходимые для реализации нового фенотипа, различны для разных микроорганизмов и разных типов мутаций. Методов распознавания и отбора мутантов очень много. Наиболее часто используют: высев большого числа клеток (>10⁸) на агаризованную среду, содержащую ингибитор или бактерицидный агент; метод с применением антибиотиков; длительное выращивание при концетрации субстрата, лимитирующего рост, попеременное выращивание на двух субстратах; выращивание в присутствии вещества, подавляющего индукцию ферментов; выращивание в присутствии антиметаболитов. Методы отбора и идентификации разных типов мутантов необходимо не только знать, но и освоить на лабораторно-практических занятиях.

Рис.1. проявление мутации в прокариотической клетке, имеющей 4 копии хромосом.