3 Содержание лабораторных работ

3.1 Лабораторная работа № 1 подготовка и стерилизация посуды и сред

Цель работы: освоить подготовительные работы при проведении микробиологических анализов

Содержание работы: подготовить посуду, материалы и реактивы. Приготовить растворы и питательные среды. Ознакомление с методами стерилизации.

Материальное обеспечение: термостат, холодильник, автоклав, сушильный шкаф, рН-метр, микроскоп, бинокулярная лупа, спиртовка, пипетки, пробирки, предметные стёкла, бактериологические петли, вата, марля. На одну подгруппу студентов понадобятся: колба ёмкостью 1 л – 2 шт., колба ёмкостью 500-750 мл – 2 шт., колба ёмкостью 250 мл – 6 шт., чашки Петри 21 шт., пробирки – 24 шт., пипетки на 1 мл, шпатели Дригальского – 3 шт., кружки картонные – 9 шт.

3.1.1 Подготовка посуды

Мойка посуды. Новую посуду ополаскивают от пыли и грязи, кипятят в растворе хозяйственного мыла (200 г на 15 л воды) в течение 15 мин, ополаскивают водопроводной водой, выдерживают 48 ч в 2 % растворе соляной кислоты, ополаскивают водопроводной водой, затем дистиллированной водой. Посуду, бывшую в употреблении, обеззараживают стерилизацией в автоклаве (1,5 атм 30 мин) или кипячение в течение 1 ч, освобождают от остатков среды с помощью ершей и щеток под струей водопроводной воды, кипятят в растворе хозяйственного мыла (200 г на 15 л) в течение 15 минут промывают водопроводной водой с применением ершей и щеток и дважды ополаскивают дистиллированной водой. Для мытья нельзя применять дезинфицирующие растворы и стиральные порошки, так как их остатки могут ингибировать рост микроорганизмов.

Градуированные пипетки замачивают в воде в течение 1-2 ч при комнатной температуре, промывают струей водопроводной воде, ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой.

Сушка и хранение. Чистую посуду сушат на воздухе при комнатной температуре или в сушильном шкафу при 100-105 °С, закрывают пробками или бумажными колпачками и хранят до использования в специальных шкафах.

Стерилизация. Пробирки, колбы и флаконы закрывают ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками. Чашки Петри заворачивают по 2 шт в бумагу. Стерилизают сухим жаром в сушильном шкафу в течение 2 ч при 160 °С или автоклавированием в течение 1 ч при 1,5 атм.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или в ящиках с крышками. Срок хранения стерильной посуды не более 30 суток.

3.1.2 Приготовление питательных сред

Требования к питательным средам. Среда должна содержать основные питательные вещества, достаточное количество воды, обладать определенным осмотическим давлением, иметь оптимальную концентрацию ионов водорода, быть стерильной и желательно прозрачной. Ингредиенты растворяют согласно указанной последовательности, каждый последующий только после полного растворения предыдущего. рН среды доводят до требуемого уровня до внесения агара, иначе агар забивает электрод рН-метра. Агар вносят в холодную среду, выдерживают для набухания 20-30 мин, затем нагревают до полного растапливания агара и фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

Стерилизация сред. Питательные среды разливают в чистую посуду (колбы, бутыли, пробирки) на 2/3 объёма. Агаровые среды разливают в круглые плоскодонные колбы (не конические) во избежание проблем при расплавлении. Физиологический раствор для приготовления разведений проб разливают в пробирки по 10 мл (с учётом того, что при стерилизации 1 мо раствора испрарится) или в колбы по 93 мл. Посуду закрывают ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками. На колпачках записывают название среды и дату приготовления. Среды, предназначенные для автоклавирования текучим паром или при давлении 0,5 атм, разливают в стерильную посуду.

Подготовленные среды стерилизуют в автоклаве при режиме, предписанном для той или иной среды в зависимости от её состава. Агаровые среды, не содержащие термолабильных соединений (углевода, белки и т.п.), стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин.

Для насыщенного (сухого) пара температура стерилизации в зависимости от избыточного давления (таблица 1), а продолжительность стерилизации от объёма (таблица 2).

Таблица 1 – Зависимость температуры стерилизации от избыточного давления

Режим	Температура, °С
Текучий пар	105
Избыточное давление 0,5 атм	115
Избыточное давление 1,0 атм	121
Избыточное давление 1,5 атм	135

Таблица 2 – Зависимость продолжительности стерилизации от объёма среды

Объём среды, мл	Время прогрева, мин
500	8
1000	12
2000	20

Необходимо подготовить жидкую синтетическую питательную среду на основе сахарозы, 1500 мл, разливается в 2 колбы ёмкостью 1 л и в 2 колбы ёмкостью 500-750 мл.

Состав питательной среды, г/л:

– глюкоза – 50,0;

– NH₄H₂PO₄ – 2,0;

– KCl – 0,5;

– MgSO₄ 7H₂O – 0,25;

– FeSO₄ – 0,15;

– MnSO₄ – 0,015;

– дрожжевой экстракт – 5.

Среду стерилизовать 10 мин при 1 атм.

Необходимо приготовить твёрдые агаризованные питательные среды для контроля качества засевных дрожжей упрощенным методом. Для выявления общего количества бактерий – 75 мл питательной среды. В качестве среды можно использовать дрожжевой агар с 4 % сахарозы, либо сусло-агар с 12 % сухих веществ. Для выявления кислотообразующих бактерий – 75 мл такой же среды с добавлением 4 % мела. Для выявления спорообразующих бактерий – 75 мл среды.

Необходимо приготовить твёрдые агаризованные питательные среды для контроля численности молочнокислых бактерий, например среду для КМАФАнМ, 300 мл, разлить в 3 колбы ёмкостью 250 мл. В 24 пробирки наливают физиологический раствор (0,9 %-ный раствор хлорида натрия) по 10 мл (с учётом того, что при стерилизации 1 мо раствора испрарится).