Примеры разделения и обнаружения ионов на бумаге, пропитанной осадителем

Осадитель	Растворитель	Проявитель	Ионы	Окраска зоны
KI, 5%-ный раствор	Вода	—	Hg2++ Ag+ Cu++	Желто-зеленая Светло-желтая Бурая
Тартрат натрия, 4%-ный раствор	»»»	Родизонат натрия, рН 2,78	Pb++ Ba++	Темно-фиолетовая Буро-красная (после проявления оранжево-красная)
Силикат натрия, 4%-ный раствор	NH3, 10%-ный раствор.	Рубеановодород- ная кислота, спир- товой раствор	Cu++ Co++ Ni++	Оливково-зеленая (по- сле проявления) Желтая (после проявления) Синяя (после проявле­ния)

Биохимические методы

Среди современных методов химического анализа важное место зани­мают биохимические методы. Все более широкое использование этих мето­дов связано, во-первых, с возможностями решения с их помощью ряда акту­альных задач аналитической химии и, во-вторых, с тем, что с развитием био­логии, биохимии, методов разделения и очистки веществ все более доступ­ными и дешевыми становятся средства для проведения такого анализа.

К биохимическим методам относят методы, основанные на использовании процессов, происходящих с участием биологических компонентов (ферментов, антител и т.п.). Аналитическим сигналом при этом чаще всего являются либо начальная скорость процесса (см. разд. 9.3), либо конечная концентрация одного из продуктов реакции, определяемая любым инструментальным методом (спектрофотометрическим, люминесцентным, электрохимическим и т. д.). Рассмотрим сущность и области применения биохимических методов.

Среди разновидностей биохимических методов химического анализа (иммунохимических, ферментативных, РНК и ДНК-зондов и др.) наибо­лее часто используют ферментативные и иммунохимические.

Ферментативные методы

Ферментативные методы основаны на использовании реакций, ката­лизируемых ферментами — биологическими катализаторами, отли­чающимися высокой активностью и избирательностью действия.

М ногие ферменты — комплексы, состоящие из нескольких молекул белка (субъединиц), соединенных между собой нековалентными связями. Установлено, что белковая часть фермента (апофермент) может быть связана с небелковыми компонентами (кофакторами), такой комплекс называется холоферментом.

Активным центром фермента называют участок молекулы, на котором происходит превращение субстрата (вещества, превращение которого катализирует фермент). Иногда вы­деляют участок, связывающий суб­страт, и каталитический участок, со­держащий каталитически активные группы белка или кофакторы (часто эти участки совпадают). Для многих ферментов, состоящих из субъеди­ниц, характерно наличие так называ­емого регуляторного участка, кото­рый взаимодействует с веществами, влияющими на активность фермента, т.е. его эффекторами – активаторами, повышающими активность, или ингибиторами, понижающими активность фермента (рис. 9.36).

Ферменты обладают рядом уникальных свойств, которые выделяют их на фоне обычных органических катализаторов. Прежде всего это необычайно высокая каталитическая активность. Так, добавка незначительной концентрации фермента (10^-9-10^-7 М) ус­коряет превращение субстрата в 10⁸-10¹² раз. Другое не менее важное свойство ферментов — избирательность (специфичность) их действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения. Специфичность определяется способностью фермента превращать только данный тип субстратов в определенных реакциях и условиях. Эти свойст­ва ферментов обусловлены сложной структурой макромолекул белка и сложным механизмом их действия. Механизм этот заключается, в частно­сти, в сорбции субстрата на ферменте и образовании ими активного ком­плекса в результате гидрофобных, полярных и ионных взаимодействий; в этом комплексе происходит сближение и ориентация реагирующих групп фермента и субстрата. Взаимодействие между ферментом и сорбированным субстратом имеет полифункциональный характер, при котором мо­лекула субстрата подвергается атаке сразу нескольких каталитических групп активного центра фермента, что и обусловливает, в частности, его высокую каталитическую активность.

Важным свойством ферментов, которое необходимо учитывать при практическом их использовании, является стабильность, т. е. способ­ность сохранять каталитическую активность. При хранении и особенно в ходе ферментативной реакции фермент может частично или полностью терять свою каталитическую активность (инактивироваться).

Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизация, т. е. перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицирование водорастворимыми поли­мерами с полным или частичным сохранением ферментами каталитиче­ской активности.

Разработаны физические и химические способы иммо­билизации ферментов. К физическим способам иммобилизации относят­ся: адсорбция на нерастворимых носителях; включение в пбры геля или полимера; пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы полупроницаемой перегородкой (мембраной). Хи­мическая иммобилизация осуществляется за счет создания ковалентных связей между белком и носителем с участием «сшивающих» агентов (например, глутарового альдегида).

Повышение стабильности ферментов вследствие иммобилизации значительно облегчает их хранение, транспортировку, применение в экс­педиционных условиях, а возможность многократного использования иммобилизованных ферментов значительно повышает экономичность ферментативных методов анализа.

Ферментативными методами можно определять субстраты, актива­торы, обратимые и необратимые ингибиторы ферментов. Пределы обна­ружения определяемых веществ зависят не только от каталитической ак­тивности фермента, но и от других кинетических характеристик исполь­зуемой индикаторной реакции.

Простейшая односубстратная реакция описывается обычно схемой Михаэлиса — Ментен

где Е — фермент; S — субстрат; ES —промежуточный комплекс фермен­та с субстратом (комплекс Михаэлиса); Р — продукт.

При [Е]≪[S]₀ на­чальная стационарная скорость образования продукта описывается урав­нением

где k_кат=k₂, K_m=(k_-1+k₂)/k₁.

Согласно уравнению (9.76), концентрация субстрата [S]_o будет пропорциональна _o только при [S]_o K_m. Тогда

Следовательно, верхняя граница определяемых концентраций суб­страта ограничена константой Михаэлиса (K_m). Нижняя граница опре­деляемых концентраций субстрата определяется величиной _o, которая может быть зафиксирована с помощью используемого для наблюдения инструментального метода. Причем величина _o тем выше для одного и того же значения [S]_o, чем выше k_кат и [Е]. Таким образом, использова­ние высокоактивного фермента (большое значение k_кат) и повышение его концентрации в реакционной смеси может существенно снизить предел обнаружения субстрата.

Несколько другие кинетические закономерности следует учитывать при оп­ределении тех веществ, которые являются эффекторами ферментов.

Обратимые неконкурентные ингибиторы, взаимодействуя с ферментом, об­разуют каталитически неактивные комплексы EI по реакции

где I —ингибитор; К₁ = [Е1]/([Е]·[I]) — константа ингибирования.

Можно показать, что верхняя граница определяемых концентраций обрати­мых ингибиторов зависит от величины К₁. Аналогичные ограничения существу­ют и при определении обратимых активаторов ферментов.

Разработано большое число высокочувствительных и селективных ферментативных методов определения субстратов и эффекторов фермен­тов — неорганических (ионов металлов, анионов) и органических (N-, S-, Р-, 0-содержащих) соединений. Методы определения эффекторов менее селективны, но часто более чувствительны, чем методы определения суб­стратов.

В табл. 9.15 приведены некоторые методы определения субстратов и ингибиторов ферментов.

Ферментативные методы широко применяют при анализе разнооб­разных объектов — медицинских (биологических жидкостей, крови, тка­ней живых организмов); пищевых продуктов; фармацевтических препа­ратов; для непрерывного контроля микробиологических и биохимических процессов в производстве. Эти методы используют для определения токсичных органических и неорганических соединений в объектах окру­жающей среды — сточных и природных (речных, морских, подземных и др.) водах, почвах, листьях растений и т.д.

Таблица 9.15.

Примеры использования ферментов для определения их субстратов (I) и ингибиторов (II)

Класс ферментов, фермент	Индикаторная реакция	Определяемое вещество	сн*,М
Оксидоредуктазы	Окислительно-восстановительная
Пероксидаза	Гомованилиновая кислота— Н202	Н202 (I)	5-10-9
	о-Дианизидин— Н202	Hg2+ (П)	1-10-13
Алкогольоксидаза	Этанол — НАД**	Этанол (I)	1·10-5
Ажогольдегидрогеназа	Этанол — НАД	Ag+ (П)	1 10-11
Гидролазы	Гидролиз субстрата
Уреаза	Гидролиз мочевины	Мочевина (I)	1-10-6
Щелочная фосфатаза	Гидролиз n- нитрофенилфосфата	Рb2+ (П)	2-10*12
Кислая фосфатаза	Гидролиз n- нитрофенилфосфата		3-10-10
Холинэстераза	Гидролиз бутирилтиохолиниодида	Р-содержащие пестициды (П)	n·10-11

* Сн — нижняя граница определяемых концентраций; ** НАД — никотинамидадениндинуклеотид.

Илинунохимические методы анализа

Иммунохимические методы анализа (ИХА) основаны на специфиче­ском связывании определяемого соединения — антигена соответствую­щими антителами (специфическими белками крови, образующимися в результате иммунологических процессов, направленных на удаление из организма антигенов — генетически чужеродных тел). Иммунохимическая реакция в растворе между антителами и антигенами — сложный процесс, протекающий в несколько стадий. В иммунохимическом анализе принципиально возможно использование только первой стадии, которой является обратимое образование комплекса состава 1:1.

Классические методы иммунохимического анализа основаны на об­разовании осадка антителами в присутствии антигена. При этом за проте­канием этого процесса обычно наблюдают визуально и обнаруживают или полуколичественно определяют относительно высокие концентрации компонентов. Эти методы длительны и трудоемки.

Определение малых концентрации комплекса антиген—антитело, образовавшегося в растворе, становится возможным, если в один из исходных компонентов реакционной системы (антиген или антитело) ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высо­кочувствительным инструментальным методом. Поскольку комплекс между определяемым соединением (антигеном) и специфическим ан­тителом образуется строго стехиометрично, экспериментально уста­навливаемая концентрация метки, входящей в состав образующегося иммунохимического комплекса, непосредственно связана с концен­трацией антигена.

Для проведения такого анализа необходимо эффективное отделе­ние комплексов от свободных компонентов. Эта задача достаточно легко решаема, если антиген, либо антитело иммобилизовать на твер­дом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и разделить иммунные комплексы и свободные компоненты. Возможность прочного связывания на носителе антигенов или анти­тел с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов привела к созданию твердофазных иммунохимических методов, широко используемых в настоящее время в хими­ческом анализе.

Чаще всего в ИХА используют изотопные, флуоресцентные, ферментные, парамагнитные метки, которые повышают чувствитель­ность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа со­кращается до нескольких часов.

Радиоиммунологический метод анализа (РИА) был предложен в конце 50-х годов. Возможность определять метку (изотоп ¹²⁵I) в очень малых концентрациях позволила достичь высокой чувствительности ана­лиза (до пкг/мл) при высокой избирательности и экспрессности. За разра­ботку этого метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон были удостоены Но­белевской премии в 1977 г. Недостатками этого метода являются ограни­ченный срок жизни радиоактивной метки; относительно дорогое обору­дование для регистрации радиоактивности; возможность радиоактивного заражения окружающей среды при проведении серийных анализов. В качестве альтернативы радиоактивным меткам было предложено исполь­зовать флуоресцентные метки и ферменты.

Иммуноферментный анализ (ИФА) является в настоящее время одним из наиболее активно развивающихся направлений аналитической биохимии. В этом методе высокая чувствительность определения фер­ментной метки (менее 10^-12 М) сочетается с уникальной специфичностью иммунохимического анализа. Достижению высокой чувствительности ИФА способствует использование различных инструментальных методов для регистрации активности ферментов — спектрофотометрических, флуориметрических, хеми- и биолюминесцентных, электрохимических.

Использование твердых носителей для иммобилизации антител с по­следующим специфическим связыванием определяемого соединения на сорбенте и идентификацией образовавшихся иммунокомплексов с помо­щью меченных ферментами компонентов лежит в основе методов твердофазного иммуноферментного анализа (метод гетерогенного ИФА).

Метод гомогенного ИФА без использования твердой фазы основан на различии каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунном комплексе. В настоящее время термин «гомогенный иммуноанализ» применяют к любой системе иммуноанализа, в которой специ­фическая реакция взаимодействия антигена с антителом и регистрация глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе.

Отсутствие стадии разделения свободного и меченого определяемого со­единения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Это позволило разработать диагностические иммуноферментные тест-системы для экспресс-определения биологически активных соединений в хи­мической токсикологии, фармакологии, эндокринологии.

Иммунохимические методы, основанные на использовании меченых реагентов, широко применяют для определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры — от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток. Внедрение гомогенного варианта ИФА в область клинической биохимии содейство­вало созданию высокочувствительных методов определения гормонов, наркотических и лекарственных веществ. Большим преимуществом этого метода является возможность использования малых объемов анализируе­мой пробы (5—50 мкл) и отсутствие стадии пробоподготовки.

Иммунохимические методы анализа все активнее внедряются в ана­литическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, при анализе объектов окружающей среды.

18