1.Ферменты

Большинство ферментов выделяют из клеток бактерий и используют для «разрезания» или «сшивания» ДНК как прокариотических, так и эукариотических клеток.

- Ферменты, с помощью которых выделяют фрагменты ДНК (рестриктазы);

-ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (ДНК-полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы, ревертазы);

-Ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

-Ферменты, изменяющие строение концов фрагментов ДНК.

Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции) выделяют из бактерий (дрожжей, и одноклеточных водорослей). Номенклатура рестриктаз предложена в 1973 г С.Смитом и Д.Натансом. Названия ферментам дают по тем бактериям, из которых они выделены. Первая буква названия обозначает род микрооргнаизма, две следующие – его вид; далее идет порядковый номер данной рестриктазы в ряду эндонуклеаз, выделенных из данного организма. Например: рестриктазы Hpa I, HpaII – ферменты, выделенные из Haemophilus parainfluenzae; Eco RI – рестриктаза, выделенная из E.coli.

Естественной функцией рестриктаз является защита бактерий от чужеродной ДНК (прежде всего от ДНК бактериофагов, которая может проникнуть в клетку и вызвать ее трансформацию). Они ограничивают возможность размножения фаговой ДНК, разрезая ее на части. Фермент рестрикции не может разрезать свою собственную ДНК.

Определенные рестриктазы узнают в ДНК последовательности из нескольких нуклеотидов, осуществляя либо несимметричные, либо симметричные разрывы. При расщеплении молекула ДНК разрезается с образованием так называемых «липких» или «тупых» концов. «Липкие концы» образуются когда разрывы в разных цепочках ДНК происходят со смещением друг относительно друга (рестриктазы Eco RI; Hind III)/, а «тупые» - когда разрывы в цепочках возникают друг против друга (рестриктазы Tag I; Hpa I, Sma I). В н.в. выделено свыше 2000 рестриктаз, которые могут узнавать более 150 сайтов рестрикции.

Обратные транскриптазы, ДНК-полимеразы - ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (ДНК-полимеразы) или РНК (Обратные транскриптазы, ревертазы).В генетической инженерии часто используется ДНК –полимераза Ш, выделенная А. Корнбергом и сотрудниками в 1958 г. из клеток E.coli. ДНК –полимераза в естественных условиях в клетке играет важную роль в репарации (восстановлении структуры) поврежденной ДНК, осуществляя так называемую ник-трансляцию (ник-разрыв в одной из цепей ДНК).

РНК-зависимая ДНК-полимераза, ревертаза – это ферменты, которые используют для синтеза комплементарной цепи ДНК с мРНК. Впервые их выделили Г.Темин и С.Мизутани в 1970г. из вируса саркомы Рауса. Полученную двуцепочечную комплементарную молекулу ДНК (кДНК) можно замтем встраивать в векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований.

Лигазы - ферменты, которые «сшивают» фрагменты ДНК. Для лигирования фрагментов ДНК используют универсальную лигазу фага Т4, которая может сшивать как «липкие», так и «тупые» концы. ДНК лигазы в естественных условиях необходимы в процессах репарации ДНК и репликации –при удвоении цепи ДНК.

Ферменты, изменяющие строение концов фрагментов ДНК. Нуклеаза Bal 31 – это фермент, неспецифически удаляющий нуклеотиды из последовательности ДНК.