Лекция № 2

Тема: Использование методов рекомбинантной ДНК в медицинской и ветеринарной биотехнологии (Генно-инженерное микробиологическое производство).

1. Определение генетической инженерии. История развития генетической инженерии. Понятия «генетическая инженерия», «рекомбинантная молекула ДНК», гибридный –«хемерный» белок, вектор, рестриктазы, структурный ген

2. Технология получения рекомбинантных ДНК.

   1. Ферменты

   2. Секвенирование ДНК (определение нуклеотидной последовательности ДНК)

   3. Конструирование фрагментов рекомбинантных ДНК («сшивка»)

   4. Гибридизация – метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов

   5. Методы клонирования ДНК

   6. Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы

3. Сконструированные методами генной инженерии штаммы микроорганизмов, продуцентов биологически активных соединений.

Литература основная

1. Егоров. Промышленная микробиология. –М.,1989. – гл.5. – С.96-113.

Цель лекции: усвоить предмет генно-инженерных работ и ознакомиться с основами получения полезных штаммов микроорганизмов с использованием генетической инженерии.

1. История создания генетической инженерии.

Генная инженерия как научная дисциплина родилась 31 июля 1972 г., когда в труды Национальной академии наук США была представлена первая генно-инженерная работа Пола Берга об искусственном получении химерного генома: гибрида обезьяннего вируса SV40 и бактериофага лямбда. В этой работе речь шла о «сшивании in vitro фрагментов геномов двух вирусов весьма удаленных друг от друга в систематическом отношении, и последующей репликации данной химеры в форме плазмиды в бактериальной клетки.

Генетическая инженерия – это область молекулярной и клеточной генетики, связанная с целенаправленным созданием in vitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клетке хозяина и синтезировать конечные продукты обмена. Иначе, перестраивать геномы по намеченному плану, изменяя в них генетическую информацию.

Генетическая инженерия – это конструирование функционально активных генетических структур в виде рекомбинатных (гибридных» молекул ДНК. Генная инженерия изучает закономерности конструирования in vitro рекомбинатных молекул ДНК и поведение их в реципиентной клетке. Цель этого метода – создание новых генетических структур. Успехи генной инженерии восхитительны, а перспективы поразительны.

Рекомбинантная молекула ДНК - молекула ДНК, в состав которой встроен фрагмент другой молекулы ДНК. В западной литературе «генная инженерия» именуется как «работа с рекомбинантными молекулами ДНК». Фрагментирование молекул ДНК и воссоединение их in vitro возможно с помощью ферментов, называемых рестриктазами, лигазами, ревертазами.

Рекомбинатную молекулу ДНК необходимо ввести в производственно-удобный штамм, а это возможно с помощью так называемых ВЕКТОРОВ. Векторы – это молекулы ДНК способные к автономной репликации в определенном микроорганизме. Это может быть бактериофаг или плазмида.

Для создания рекомбинантной молекулы ДНК необходим структурный ген нужного белка, т.е. структурный ген - это исходной ген в котором зашифрована информация о конкретном белке.

Гибридный или химерный белок – новый белок.

2.Технология получения рекомбинантных днк.

Основной предмет генно-инженерных работ

Существо генно-инженерных работ сводится к триаде:

1. Ферменты (рестриктазы, лигазы, ревертазы, вспомогательные ферменты)

2. Гены (структурные гены) (из днк-геномов, обратная транскрипция рнк- геномов и иРнк, химический синтез)

3. Векторы ( плазмиды, фаги, космиды, дрожжевые плазмиды, вирусы животных). Технология получения рекомбинантных днк включает следующие методические подходы (этапы):

1. Получение структурного гена, предназначенного для переноса в другой организм.

2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в определенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность.

3. Включение структурного гена в вектор т.е. создание рекомбинантной ДНК.(конструирование рекомбинантной ДНК)

4. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять с большой точностью и чувствительностью специфические последовательности РНК или ДНК, основанные на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот.

5. Клонирование ДНК путем введения ее фрагмента в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий, или амплификация in vitro; создание геномных библиотек.

6. Перенос рекомбинантной молекулы ДНК в удобный для промышленного производства микроорганизм. (кишечная палочка),

7. Оптимизация и анализ экспрессии чужеродной ДНК в микробной клетке.

8. Синтез необходимого белка клетками микроорганизмов с измененным геномом (такие организмы называют трансгенными или трансформированными)

Каждая из этих задач сама по себе чрезвычайно сложна. Выделение и направленный перенос генов в природном материале были описаны более 50 лет тому назад. Когда было открыто явление трансдукции. Суть которой заключается в том, что фаги, покидая бактерию, часто захватывают участок бактериальной ДНК, несущей определенную группу генов. У таких вирусов легче всего было найти ген клеток, заведующий определенной функцией. Например, лактозный ген, отвечающий в бактериях за способность усвоения лактозы. В результате ряда манипуляций был выделен лактозный ген. При исследовании под электронным микроскопом было определено, что длина его составляет 1.4 мкм, что соответствует 4000 пар оснований.

Краткое пояснение этапов генно-инженетных работ с микроорганизмами.