Материалы и оборудование

Для исследования свободноживущих азотфиксаторов: жидкая среда Виноградского; колбы Эрленмейера емкостью 100-150 мл или высокие пробирки; почва; чайные ложки или шпатели; раствор Люголя; гелевые пластины, пропитанные средой Виноградского для азотобактера; часовые стекла; колбы на 100 мл; микроскопы и все необходимое для микроскопирования.

Для исследования симбиотических азотфиксаторов: стерильные чашки Петри, пробирки со стерилизованной водой, спирт 96⁰-ный, пинцеты, бобовые растения с клубеньками на корневой системе, питательные среды (бобовый агар, среда Лазаревой, среда для выращивания растений), аппарат Кьельдаля, все реактивы для определения общего азота микрометодом Кьельдаля и нитрогеназной активности ацетиленовым методом, пробирки или колбы для выращивания растений, семена бобовых растений, концентрированная серная кислота, колбы емкостью 1 л со стерилизованной водопроводной водой для отмыва кислоты от семян.

Работа 6. Исследование азотфиксирующей активности ацетиленовым методом в лабораторных условиях

Цель работы - овладеть простым и быстрым методом определения потенциальной активности азотфиксации в почве для оценки происходящих изменений в результате проведения агротехнических мероприятий, а также различного рода антропогенных воздействий. Метод позволяет провести раннюю диагностику загрязненности почв агрохимикатами и тяжелыми металлами. Результаты такого обследования можно использовать при санитарно-гигиеническом нормировании токсических веществ и соединений в почве. Важно ознакомиться также с ацетиленовым методом определения азотфиксирующей активности бактерий у чистых (или накопительных) культур, поскольку ацетиленовый метод примерно в 10³ раз более чувствителен, чем изотопный метод, и в 10⁶ раз, чем метод измерения фиксации азота по Кьельдалю. Вследствие этого длительность проведения анализа в зависимости от активности исследуемого образца субстрата не превышает 1-24 ч, в то время как при использовании других методов не­обходимо проведение длительных (до 2 мес.) экспериментов. К тому же анализ с помощью ацетилена и этилена (С₂Н₂ и С₂Н₄) проводится без каких-либо предварительных химических обработок, что также дает возможность при необходимости повторить анализы на одних и тех же образцах, не разрушая их. Метод легко применим в лабораторных и полевых условиях, отличается большой эффективностью, поскольку требующееся оборудование, кроме газового хроматографа, стоит недорого и является простым в обращении.

Ход работы

1. Определение потенциальной активности азотфиксации. 5 г освобожденной от корней и просеянной через мелкое сито почвы помещают в пенициллиновый флакон, вносят 2% глюкозы (от массы абсолютно сухой почвы) и увлажняют стерилизованной водопроводной водой до 80% полной влагоемкости. Почву тщательно перемешивают стеклянной палочкой, закрывают флакон ватной пробкой и ставят на сутки в термостат при 28⁰. Из каждого образца отбирают не менее трех навесок для определения потенциальной активности азотфиксации. Через сутки инкубации в термостате ватные пробки заменяют на резиновые, закрепляют зажимами и вводят в них шприцем около 0,5 мл ацетилена, затем вновь помещают фла­кон в термостат. Через 1 ч (24 ч) шприцем отбирают газовую пробу объемом 0,5 мл и вводят ее для анализа в газовый хроматограф. Контроль - флакон с почвой без ацетилена (для определения неспецифического эндогенного выделения этилена). После окончания измерений резиновые пробки снова заменяют на ватные и флаконы помещают на сутки в термостат. Затем анализ повторяют: вводят ацетилен и определяют количество образовавшегося этилена. Измерение считается законченным, если в двух (ближайших по времени взятия) пробах количественное содержание этилена различается не более чем на 5 %. Полученные данные характеризуют потенциальную активность азотфиксации в исследуемой почве. Этилен определяют по стандартным пикам калибровочной кривой. Количество фиксированного азота в почве рассчитывают по формуле:

А= ((а₂ – а₁)*2N*V₀*1000)/(V₁*3*m),

где А - количество фиксированного азота в г на 1 кг почвы за 1 ч;

а₂ - количество восстановленного этилена в наномолях С₂Н₄ на 0,5 мл

газовой пробы за 1 ч;

a_l - количество фонового этилена в наномолях на 0,5 мл газовой пробы

за 1 ч;

N - молекулярный вес азота, г;

V_o объем газовой фазы реакционного сосуда, мл;

V₁ - объем газовой пробы, вводимой в колонку хроматографа, мл;

3 - коэффициент, определяющий соотношение между восстановленным

этиленом и аммиаком;

m - вес опытной навески, г.

2. Определение азотфиксирующей активности в чистых или накопительных культурах. Существуют следующие варианты определения азотфиксирующей активности:

1) 5 мл бактериальной суспензии переносят в стерильные пенициллиновые флаконы, снабженные специальными зажимами для закрепления резиновых пробок. Резиновые пробки кипятят в течение 20 мин. Из флаконов медицинским шприцем откачивают воздух и дважды заполняют аргоном. Затем вводят 0,5 мл ацетилена, после чего флаконы инкубируют в термостате. В зависимости от уровня нитрогеназной активности через определенные отрезки времени (1-3 или 24 ч) определяют содержание этилена на газовом хроматографе;

2) питательную среду разливают по 15-20 мл в специальные флаконы емкостью 25 мл, вносят в среду чистые культуры. Флаконы помещают в термостат при 28-30⁰. На 1-3-е сут (в зависимости от скорости роста штамма) ватные пробки заменяют резиновыми и закрепляют зажимами, через которые вводят ацетилен, затем инкубируют 1-3 ч и проверяют наличие этилена.

3. Определение нитрогеназной активности. Нитрогеназную активность измеряют в присутствии 10% -ного ацетилена, помещая 1 мл суспензии клеток в пенициллиновые флаконы емкостью 10 мл, снабженные специальными зажимами для закрепления резиновых пробок. В контрольные пробирки ацетилен не вводят.

Фиксацию азота устанавливают, учитывая нитрогеназную активность по концентрации образующегося этилена:

М С₂Н₄ = ((а₂ – а₁)*V₀)/(V₁*m) = (а - V₀)/ (V₁*m),

где М С₂Н₄ - моль этилена на единицу массы за 1 или 24 ч;

а₂ - количество восстановленного этилена в наномолях С₂Н₄; на 0,5 мл

газовой пробы;

a_l - количество фонового этилена;

V₀ - объем газовой фазы реакционного сосуда, мл;

V₁ - объем газовой пробы, вводимой в колонку хроматографа, мл;

m - вес (объем) опытной навески.

4. Работа на газовом хроматографе. Степень активности процесса азотфиксации определяется косвенным путем на основе количественных изменений образовавшегося этилена. Анализ газовых проб проводят на газовом хроматографе любой модели, снабженном пламенно-ионизированным детектором (ПИД). Колонка прибора должна обеспечивать хорошее разделение газов (этилен, ацетилен). Газоносителями могут быть азот, аргон или гелий; адсорбентом - силикагель, парапак или другие материалы подобного класса. Прибор калибруют по этилену, измеряют температуру, давление газов. Объем вводимой пробы газовой смеси обычно составляет 0,5 мл.

Пробу вводят медицинским шприцем (или микрошприцем), при этом необходимо следить за плотностью прилегания поршня к стенкам. После каждого определения шприц необходимо «промывать» воздухом или инертным газом для удаления адсорбированных газов. Соотношение между восстановленным азотом и этиленом должно составлять 1 : 3, т. е. данные, полученные для этилена, необходимо разделить на три, чтобы получить величину активности фиксации азота.