Лекция № 6 Биофизика фотобиологических процессов

Транспорт возбужденных электронов, обеспечивающий аккумулирование (конвертирование) солнечной энергии в макроэргических связях АТФ, свойствен хлорофиллсодержащим бактериям и зеленым растениям.

Хлорофилл обладает уникальной способностью быть как донором, так и акцептором электронов в зависимости от действия на него солнечного света. В исходном состоянии (когда на него не действует свет) хлорофилл служит донором электронов. Поглотив фотон в видимой области солнечного излуче­ния, этот пигмент теряет электрон, окисляется и приобретает акцепторные свойства. Принимая электрон от сопряженных с ним веществ, он снова ис­пытывает восстановление и становится готовым отдать электроны, если на него вновь подействует свет. Такая цикличность в работе хлорофилла позво­ляет называть его «электронным насосом», приводимым в действие и регу­лируемым солнечной энергией. Это свойство хлорофилла открыто в 1948 г. академиком А. А. Красновским. Его открытие вошло в науку под названием реакции обратимого фотохимического восстановления хлорофилла (реакции Красновскош).

Фотосинтез у хлорофиллсодержащих бактерий

У хлорофиллсодержащих бактерий хлорофилл сосредоточен в плазмо- лемме. Там же присутствуют и другие вещества, участвующие в переносе электронов, которые возбуждаются солнечной энергией в молекуле хлорофилла и покидают ее. Мембрана обеспечивает тесное взаимодействие всех компонентов фотосинтетического комплекса. Благодаря его упорядоченной мембранной организации промежутки между соседними компонентами это­го комплекса имеют порядок 1 нм, что обеспечивает миграцию возбужденных я-электронов между молекулами по резонансному механизму.

Фотон видимого света, поглощаясь молекулой хлорофилла, возбуждает в ней электрон, который переносится на феофитин, а с него — на убихинон и далее — на цитохром с. Убихинон сосредоточен на внутренней стороне плазмолеммы, а цитохром с — на наружной. Расстояние между ними более 2,5 нм. Чтобы передать электрон цитохрому с, убихинон должен пересечь плазмо- лемму. Для этого он превращается в убихинол, присоединив вместе с парой электронов два протона, которые мембрана черпает из цитоплазмы. Убихинол перемещается от внутренней стороны плазмолеммы к наружной и, отдавая там электроны цитохрому с, окисляется с отдачей 2Н⁺ и выделением их в ок­ружающую среду. Поглощение одного фотона обеспечивает перенос одного Н⁺-иона через плазматическую мембрану хлорофиллсодержащей бактерии.

Содержание Н⁺ в цитоплазме выше, чем в окружающей среде. Следовательно, система электронного транспорта в фотосинтетическом комплексе плазмолеммы хлорофиллсодержащей бактерии обеспечивает то же, что и бактериородопсин в плазматической мембране галобактерии, — трансмембранный перенос Н⁺-ионов в соответствии с их концентрационным градиентом.

Пассивный транспорт протонов приводит к эффекту обращения протонной помпы, сосредоточенной также в плазмолемме. В результате Независимая АТФаза (Н-АТФаза), являющаяся главным компонентом протонного насоса, катализирует не гидролиз АТФ, а его синтез из АДФ и ортофосфата, т. е. выполняет роль АТФсинтазы. За счет АТФ осуществляются все процессы жизнедеятельности хлорофиллсодержащей бактерии, включая под держание ионных градиентов на ее плазматической мембране.

Такие микроорганизмы не способны синтезировать углеводы за счет работы фотосинтетического комплекса, поскольку возбужденные электроны, отдав фитину, убихинолу и цитохрому избыточную энергию, возвращаются с цитохрома на молекулу хлорофилла.

Итак, фотосинтез у хлорофиллсодержащих бактерий ограничен образованием АТФ за счет реализации протонного градиента на плазматической мембране. Дальнейшая эволюция жизни связана с появлением у зеленых растений способности использовать фотосинтез для созидания углеводов и других высокомолекулярных органических веществ. Клетки зеленых растений (автотрофов) обеспечивают за счет фотосинтеза питательными веществами, а значит, и свободной энергией как самих себя, так и гетеротрофов. Для синтеза углеводов электроны, возбужденные светом в хлорофилле, должны не только регулировать трансмембранный перенос Н⁺-ионов, но и переноситься на другие вещества, вплоть до С0₂, а не возвращаться в молекулы, которым они прежде принадлежали. Поэтому цепь переноса возбужденных электронов, замкнутая у хлорофиллсодержащих бактерий, становится разомкнутой у зеленых растений.

Фотосинтез у зеленых растений

Энергия фотонов преобразуется в энергию химических связей синтезируемых органических веществ.

Скорость фотосинтеза измеряется количеством кислорода, выделенного за единицу времени. Она зависит от интенсивности поглощенного света. Максимальная скорость фотосинтеза при постоянном сильном освещении достигает одной молекулы 0₂ (на одну молекулу хлорофилла) за 50 с. Источ­ником всего атмосферного кислорода служит вода, участвующая в реакциях фотосинтеза.

При восстановлении углекислого газа до углевода осуществляется перенос 4 атомов водорода с Н₂0 на С0₂. Изменение свободной энергии в реакциях фотосинтеза при образовании одной молекулы 0₂ составляет около 500 кДжмоль¹, на что затрачивается 8 квантов света с суммарной энергией примерно 1470 кДж моль¹. Следовательно, коэффициент использования сол­нечной энергии при фотосинтезе достигает 34%. Примерно к такому же КПД можно прийти путем другого расчета — при сопоставлении энергии, заклю­ченной в 8 фотонах, с энергией, затрачиваемой на синтез углеводов.

Свободная энергия, затрачиваемая на транспорт электронов против разности потенциалов при переносе атомов водорода с Н₂0 на С0₂ черпается из фотохимических процессов, в которых участвует хлорофилл. Каждая моле­кула хлорофилла тесно связана с донором (Д) и акцептором (А) электронов. Поэтому при ее фотовозбуждении происходят следующие превращения. Акцептор принимает электрон от возбужденного хлорофилла и превращается в А^-. Место этого электрона в хлорофилле занимает другой, принимаемый им от донора. Электрон не может перейти с донора на акцептор непосредственно, так как они пространственно разобщены и не взаимодействуют между собой. Пространственное разобщение их обеспечивается тем, что донор и акцептор являются компонентами биологической мембраны и фиксированы в ее определенных точках. Не взаимодействуя между собой, А' и Д⁺, образо­вавшиеся под действием света при участии хлорофилла, могут участвовать в других окислительно-восстановительных реакциях с теми мембранными компонентами, которые тесно контактируют с ними. Вне биомембраны фо­тосинтез не осуществляется.

Местом фотосинтеза в зеленых растениях являются мембранные системы хлоропластов. В этом специализированном органоиде, кроме двойной наружной мембраны, содержится сложно организованная сеть внутренних мембран, образующих многослойные структуры, упакованные в пачки (граны). Внутренние мембраны ограничивают замкнутые объемы в виде уплощенных пузырьков — тилакоидов. В каждом хлоропласте примерно 1000 ти- лакоидов, а в одной клетке - от 50 до 200 хлоропластов. В мембранах тилакоидов протекают светозависимые фотосинтетические реакции, так как там сосредоточены хромофоры — молекулы, поглощающие световую энергию. К ним относятся хлорофилл а, хлорофилл Ь, каротиноиды и другие пигменты. Хлорофилл поглощает свет наиболее интенсивно в синей и красной, но отражает в зеленой и желтой областях. Этим определяется зеленый цвет растений. На один хлоропласт приходится примерно 10⁹ молекул хлорофилла.

Две разновидности хлорофилла (а и Ь), имея незначительные различия в химическом строении, существенно отличаются по физическим свойствам и биологической активности. О коренных отличиях в механизмах переносаэнергии свидетельствует наличие флуоресценции у хлорофилла а (с квантовым выходом около 0,2) при ее отсутствии у хлорофилла. Последний сам по себе непосредственно не участвует в фотосинтетических превращениях, но он входит в состав светособирающей пигментной матрицы, помогающей улавливать солнечную энергию. После фотовозбуждения хлорофилл b быстро передает свою избыточную энергию хлорофиллу а, который при этом возбуждается и принимает непосредственное участие в фотосинтезе. Хлорофилл а может возбуждаться светом и без посредника, но участие хлорофилла b повышает коэффициент использования солнечной энергии. Он повышается также благодаря присутствию в светособирающей матрице других пигментов (каротиноидов и фикобилинов). Сопоставив спектры поглощения хлорофилла и каротиноидов, нетрудно убедиться, что хлорофилл поглощает энергию ограниченного участка солнечного спектра. Однако фотосинтез идет под действием почти всей видимой области электромагнитного спектра, поскольку зеленый свет хорошо поглощают каротиноиды, входящие в светособирающую матрицу. Кроме того, каротиноиды защищают хлорофилл от фотоокисления при избыточном освещении.

Перенос энергии от различных пигментов этой матрицы на хлорофилл а осуществляется по резонансному механизму. В конце концов, энергия фотовозбуждения достигает реакционного центра, в котором сосредоточено несколько молекул хлорофилла а, ориентированных определенным образом в тилакоидной мембране. Здесь начинается первая стадия фотохимического процесса. Совокупность реакционного центра и светособирающей матрицы называется фотосинтетической единицей. Каждая из них включает прибли­зительно 300 молекул хлорофилла.

Фотосинтетическая единица входит в состав фотосистемы (ФС), компонентами которой являются также интегральные белки тилакоидной мембраны. Мембранные протеины фиксируют многие молекулы хлорофилла на одной полипептидной цепи, создавая тем самым необходимую ориентировку пигмента. Комплекс «хлорофилл а — мембранный белок» служит главным узлом фотогенератора, как иногда называют фотосистему. Функциональным элементом тилакоидной мембраны считается квантосома, в состав которой входят две фотосистемы, не одинаковые по свойствам. В каждой ФС есть собственная фотосинтетическая единица, причем относительное содержание хлорофилла а в ФС I много выше, чем в ФС II. Обе фотосистемы поглощают свет с длинами волн короче 680 нм, но только ФС I способна возбуждаться и более длинноволновым светом, причем ее максимум поглощения приходит­ся на 700 нм. Поэтому хлорофилл а, входящий в разные фотосистемы, имеет различное наименование: в ФС I его называют пигментом Р₇₀₀, а в ФС II—пигментом Р₆₈₀. Различия определяются не особенностями молекулярной структуры пигментов (она одинакова), а специфическим мембранным окружением хлорофилла а в ФС I и ФС II (вероятно, составом мембранных белков, фиксирующих молекулы пигмента). В целом молекулярная масса квантосомы достигает 210⁶ дальтон. Между молекулами хлорофилла, принадлежащими разным ФС в одной квантосоме, расположены молекулы других веществ, входящих в ее состав и выполняющих функцию переноса электронов. Поэтому говорят, что ФС I и ФС II разобщены в пространстве тилакоидной мембраны, но сопряжены между собой системой переноса электронов, которые переносятся с ФС II на ФС I, и обратный переход невозможен.

В темноте молекула хлорофилла а пребывает на нижнем синглетном уровне. Световая энергия по резонансному механизму переводит его электроны на более высокий энергетический уровень. Полосы поглощения хлорофилла соответствуют переходам S —►Sj* (в красной области спектра) и S_q—>S₂* (в синей области). Раствор хлорофилла ainvitro флуоресцирует за счет обрат­ного перехода электронов с S* на S₀ (заметим, что обратный переход с S₂* на S , — безызлучательный). С уровня S₂* возможен также безызлучательный пе­реход на метастабильный триплетный уровень Т. Находясь на нем, электроны хлорофилла могут перейти под действием света на уровень Т*, что означает возбужденное триплетное состояние хлорофилла. Именно такой переход присущ хлорофиллу invivo, когда он встроен в тилакоидную мембрану. С уровня Т электроны могут возвратиться и на уровень S₀, что сопровождается фотолюминесценцией. Поэтому хлорофилл а люминесцирует не только в пробирке, но и в хлоропластах. Однако его квантовый выход invivo только 0,03-0,06, тогда как invitro — 0,2. Из сопоставления этих чисел ясно, что львиная доля энергии, выделяющейся при электронных переходах в облученной молекуле хлорофилла а, находящейся в тилакоидной мембране, идет на фотосинтез.

Фотосинтез осуществляется за счет перехода возбужденных электронов с Т на Т*, при котором изменяется их спин. Появление же неспаренных электронов приводит к образованию свободных радикалов. Возникновение свободных радикалов при фотосинтезе доказано методом ЭПР.

Полный цикл фотосинтетических превращений начинается с фотовозбуждения хлорофилла а в ФС II (Р₆₈₀). Возбужденный электрон переносится с Р₆₈₀ на акцептор, тесно контактирующий с хлорофиллом в тилакоидной мембране. По-видимому, акцептором служит цитохром 555 (Q). На переход затрачивается энергия возбуждения электрона, так как он преодолевает вос­становительный потенциал в 1,24 В (идет «в гору»). Приняв электрон, акцептор восстанавливается, а в молекуле хлорофилла, отдавшей его, возникает дырка. Она заполняется электроном воды, которая расщепляется в процессе фотосинтеза с образованием кислорода, протонов и электронов. По-видимому, расщепление воды (точнее, ее окисление до 0₂) производит не самвозбужденный хлорофилл, а некое промежуточное окисленное соединение, образующееся при возбуждении Р₆₈₀. Окисление воды, приводящее к выделению кислорода, катализируется ферментной системой, содержащей трехвалентный ион марганца.

Присоединив электрон, хлорофилл (Р₆₈₀) восстанавливается, и к нему возвращается способность возбуждаться новыми квантами света. Кислород выделяется в атмосферу. Протоны закисляют содержимое тилакоидов, под­держивая там более высокую концентрацию Н⁺ по сравнению с цитозолем. Такова судьба всех продуктов расщепления воды при фотосинтезе.

Теперь следует обратиться к электронам, покинувшим молекулы хло­рофилла (Р₆₈₀) и восстановившим вещество Q. Проследим их миграцию по цепи переноса ФС II. С вещества Q они последовательно переходят от одного компонента транспортной цепи к другому в направлении более высокого положительного восстановительного потенциала («с горы») — к пластохинону и далее к пластоцианину. Свободная энергия, выделяющаяся при этом ступенчато (дискретно), запасается тилакоидной мембраной и обеспечивает синтез АТФ из АДФ и ортофосфата. Так как скорость переноса электронов по транспортной цепи ФС II не зависит от температуры, то возникло предположение о туннельном механизме миграции электронов между окислитель­но-восстановительными компонентами этого каскада. Последним из них в ФС II является Р₇₀₀, т. е. хлорофилл а, принадлежащий другой фотосистеме (ФС I) в данной квантосоме.

Однако Р_?00 приобретает способность принять электроны из ФС II только после того, как сам поглотит свет, возбудится и потеряет свой электрон, который поступит в транспортную цепь ФС I. При потере электрона в молекуле Р₇₀₀ возникает дырка, которую и занимает электрон, пришедший сюда из ФС II (с пластохинона). Следовательно, возбужденный хлорофилл, входящий в состав ФС II, восстанавливает пластохинон (до гидрохинона), а возбужденный хлорофилл, принадлежащий ФС I, окисляет гидрохинон до пластохинона, возвращая ему способность принимать новые электроны от Р₆₈₀. Такое сопря­жение в работе двух фотосистем осуществляется в пределах одной квантосомы. В ней между молекулами хлорофилла, принадлежащими разным фото­системам, иными словами, между Р₆₈₀ и Р₇₀₀, расположено примерно 5 молекул пластохинона. Пигмент Р_?00, приняв электроны от компонентов ФС II, восстанавливается, и к нему возвращается способность возбуждаться светом.

В ФС I пока не идентифицировано вещество с наибольшим (по модулю) отрицательным восстановительным потенциалом, на которое переходят возбужденные электроны с Р₇₀₀. Обозначим его буквой X. Приняв электрон от возбужденного хлорофилла, X становится сильным восстановителем (X), с которого начинается второй каскад переноса электрона в сторону более высокого положительного восстановительного потенциала. Последним компонентом цепи транспорта электронов в ФС I является НАДФ⁺, восстанавливаемый до НАДФН. Донором водорода служит вода, расщепившаяся под действием света при участии хлорофилла (Р₆₈₀) еще на первой стадии фотосинтеза.

Конечным акцептором электронов, прошедших последовательно ФС II и ФС I, является С0₂. Перенос на него электронов с редокс-пары НАДФ⁺/ НАДФН (восстановительный потенциал равен -0,324 В) осуществляется сложной ферментной системой, входящей в так называемый цикл Кальвина — последовательность химических реакций, протекающих в 13 стадий. Энергия, выделяемая при транспорте электронов с названной редокс-пары на С0₂, недостаточна для его восстановления до углеводов. Дополнительная энергия, необходимая для синтеза углеводов, поступает в цикл Кальвина в форме АТФ. Так, образование одной молекулы гексозы из 6 молекул С0₂ обеспечивается не только переносом электронов с НАДФН на С0₂, но еще и 18 молекулами АТФ. Этот макроэрг образуется также в реакциях фотосинте­за посредством преобразования солнечной энергии, поглощенной хлорофиллом. Синтезу АТФ служит транспорт в квантосоме (в ФС II и ФС I) до этапа восстановления НАДФ⁺.

За счет поглощения двух квантов света двумя молекулами хлорофилла (Р₆₈₀ и Р₇₀₀), принадлежащими одной квантосоме, происходит перенос одного электрона на С0₂. Кроме того, энергия этих двух фотонов обеспечивает перенос одного электрона с воды на Р₆₈₀. Рассматривая процессы электронного транспорта в ФС II и ФС I в совокупности, можно заключить, что поглоще­ние двух квантов света двумя молекулами хлорофилла приводит к переносу одного электрона с Н₂0 на С0₂, из которого синтезируются углеводы.

В ходе двухтактного (в ФС II и ФС I) фотоэлектронного преобразования возникают молекулярный кислород, НАДФН (восстановленный НАДФ), а также АТФ. Это единственная, хотя и сложная (многоступенчатая) световая реакция в процессе фотосинтеза. Дальнейшие аутотрофные биосинтетические реакции не нуждаются в свете. Они происходят в зеленых растениях за счет энергии, заключенной в электронах, принадлежащих НАДФН и АТФ.

Лучше других реакций фотосинтеза изучен процесс образования шестиуглеродной молекулы глюкозы из 6 молекул С0₂ и 6 молекул Н₂0 (реакция фиксации углекислого газа). 12 пар возбужденных электронов, необходимых для осуществления этой реакции, поступают от НАДФН. Дополнительным поставщиком свободной энергии служат 18 молекул АТФ. Вклад НАДФН и АТФ в фотосинтез одного моля глюкозы составляет соответственно 660 и 252 ккал.

Аналогично углеводам происходит фотосинтез всех биологически важных макромолекул. И здесь нужно подчеркнуть, что для созидания углеводов,белков, жиров, нуклеиновых кислот и других высокомолекулярных органических соединений из двуокиси углерода, воды, нитратов, сульфатов и прочих сравнительно простых веществ необходим колоссальный приток электронов к ним.

Углеводы, белки, жиры служат основными питательными веществами для гетеротрофов. В ходе катаболических процессов, также обеспечиваемых электрон-транспортными системами, освобождаются электроны примерно в таком же количестве, в каком они захватывались органическими веществами при их фотосинтезе. Электроны, освобождающиеся при катаболизме, пере­носятся на молекулярный кислород дыхательной цепью митохондрий. Здесь окисление сопряжено с фосфорилированием — синтезом АТФ посредством присоединения к АДФ остатка фосфорной кислоты (т. е. фосфорилирования АДФ). Этим обеспечивается энергоснабжение всех процессов жизнедеятельности