1. Капсулы бактерий. Патогенные бактерии, образующие капсулы. Методы обнаружения капсул. Их значение.

Капсула или слизистый слой окружает оболочку ряда бактерий. Выделяют микрокапсулу, выявляемую при электронной микроскопии в виде слоя микрофибрилл, и макрокапсулу, обнаруживаемую при световой микроскопии. Капсула является защитной структурой (прежде всего от высыхания),адгезивную,способствуя «прилипанию» к поверхности (рецепторам) клетки хозяина.у ряда микробов- фактором патогенности, препятствует фагоцитозу, ингибирует первые этапы защитных реакций- распознавание и поглощение. У сапрофитов капсулы образуются во внешней среде, у патогенов- чаще в организме хозяина. Существут ряд методов окраски капсул в зависимости от их химического состава. Капсула чаще состоит из полисахаридов (наиболее распространенная окраска- по Гинсу), реже- из полипептидов. Непатогенные бактерии также могут образовывать макрокапсулу, выполняющую, по-видимому, только защитную функцию.

Патогенные бактерии, образующие капсулы:

• капсульные бактерии — образуют капсулу потоянно (S.aureus, S.pyogenes, K.pneumoniae, K.rhinosaeromatis и др.)

• капсулообразующие бактерии — образуют капсулу только в организме (S.pneumoniae, B. anthracis, C.perfringens).

Обнаружение капсул по методуБурри-Гинса.

1.Готовят препарат по Бурри:смешивают каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла шлифовальным краем готовят мазок,затем его высушивают и фиксируют.

2. На мазок наносят водный раствор Фуксина на 5минут

3.Прмывают водой,высушивают.

4.Нанести слой колларгола,высушить и микроскопировать.

При этом бактерии окр-ся в красный цвет,а неокрашенные капсулы контрастно выдляются на черно-розовом фоне.

Капсула защищает бактерии от фагоцитоза, антител, бактериофагов, является фактором патогенности.

2. Иммуноферментный метод исследования. Принцип метода. Определение антител с помощью ИФА.

Иммуноферментный анализ или метод — выявление ан¬тигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интен¬сивность окраски прямо пропорциональна количеству свя¬завшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных бо¬лезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепати¬та В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекар¬ственных препаратов и других биологически активных ве¬ществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (1010-1012 г/л).

Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компо¬нентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или анти¬генов. При положительном результате изменяется цвет хромоге¬на. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

I. При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сы¬воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме¬ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

II. При определении антигена в лунки с сорби¬рованными антителами вносят антиген (напр., сыворотку кро¬ви с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыво¬ротку против него и вторичные антитела (против диагностиче¬ской сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хро¬моген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест - Конкурентный ИФА для определения антител: искомые анти¬тела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с дру¬гом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

3. Бруцеллез. Этиология, принципы лабораторной диагностики, профилактика.

Бруцеллёз — зоонозная инфекция, передающаяся от больных животных человеку, характеризующаяся множественным поражением органов и систем организма человека.

Семейство: Brucellaceae

Род: Brucella

Возбудители бруцеллеза B.melitensis, B.abortus, B.suis.

Морфологические и тинкториальные свойства: Мелкие Гр–коккобактерии размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм. Также могут быть палочковидной формы; в мазках обычно расположены беспорядочно. Жгутиков не имеют. Спор не образуют.

Культуральные свойства: облигатные аэробы. B.abortus для своего роста нуждается в присутствии 5—10 % углекислого газа. Оптимальными для роста являются темпера¬тура 37С. Требовательны к питатель¬ным средам и растут на специальных средах (пече¬ночных, кровяной агар). Их особенностью является медленный (в течение 2 нед) рост. В жидких средах – равномерное помутнение с небольшим осадком. На плотных – мелкие, круглые гладкие голубые колонии. Диссоциация от S- к R-формам колоний.

Биохимическая активность: расщепляют глюкозу и некоторые другие углеводы, разлагать мочевину и аспарагин, гидролизовать белок, пептоны, аминокислоты, выделять каталазу, гиалуронидазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и другие ферменты. Внутри видов бруцелл различают биовары. Их дифференциация основана как на биохимических различиях, так и на способности расти на средах с фуксином и тионином, лизабельности фагом Т6, агглютинабельности моноспецифическими сыворотками.

Антигенная структура. O-антиген – соматический, и капсульный антигены. Две разновид¬ности О-антигена — А(абортус) и М(мелитензис). Иногда обнаруживают К-антиген. Содержат поверхностно расположенный Vi-АГ.

Факторы патогенности: Образуют эндотоксин, обладающий высокой инвазивной активностью. Продуцируют один из ферментов агрессии — гиалу-ронидазу. Их адгезивные свойства связаны с белками наружной мембраны. Факторами вирулентности бруцелл являются капсула, способность к инвазии, устойчивость к бактерицидному действию крови, секреция ферментов (гиалуронидаза и др.), которые способствуют их распространению в тканях.

Резистентность. Быстро погибают при кипяче¬нии, при действии дезинфицирующих веществ, устойчивы к низкой температуре: в замороженном мясе они со¬храняются до 5 мес, в молочных продуктах — до 1,5 мес.

Эпидемиология. Зоонозная инфекция. Источник - крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, овцы, выделяющие B.melitensis. Люди более восприимчивы к этому виду возбудителя. Реже заражение происхо¬дит от коров (B.abortus) и свиней (B.suis). Больные люди не являются источником заболевания.

Патогенез. Бруцеллы множественными путями проникают в организм хозяина. Затем благодаря выраженной инвазивности попадают в лимфу и кровь, вызывая бактериемию. С кровью они разносятся по организму, проникают и размножаются в лимфоидных клетках, образуя гранулемы в печени, селезенке, лимфоузлах. Высокая инвазивность бруцелл, вероятно, связана с гиалуронидазой и другими ферментами. При разрушении бруцелл освобождается эндотоксин, вызывая присущие ему патологические явления. Хронический метастатический характер бруцеллезной инфекции проявляется поражением кроветворной, нервной, половой системы. У беременных возникают инфекционные аборты. Бруцеллы способны персистировать в лимфоидной ткани в течение длительных сроков. Периодические обострения инфекции связаны с их размножением и поступлением в кровь.Однако в крови бруцеллы не размножаются.

Клиника: Инкубационный период составляет обычно 1—3 нед. Длительная лихорадка, озноб, потливость, боли в суставах, радикулиты.

Иммунитет: При бруцеллезе формируется напряженный гуморальный и клеточный постинфекционный иммунитет. Первый проявляется в антителообразовании: в сыворотке крови накапливаются агглютинины (вначале IgM, затем IgG) и опсонизирующие антитела, обладающие протективными свойствами. Клеточный иммунитет проявляется в аллергии замедленного типа (ГЗТ), которая выявляется с помощью кожно-аллергической пробы с бруцеллином, а также в реакции бласттрансформации лимфоцитов и торможении миграции макрофагов. Повторные заболевания практически не встречаются.

Микробиологическая диагностика:

Микробиологическая диагностика обычно проводится путем серологических исследований (реакция Райта и Хеддлсона).

Бактериологическое исследование. Для получе¬ния гемокультуры кровь засевают в два флакона печеночного бульона. Один из них (для выделения культуры В. melitensis) инкубируют в обычных аэробных условиях, другой (для выделения первич¬ной культуры В. abortus) —с СО2. В первых генерациях бруцеллы растут очень медленно. На агаре бруцеллы образуют бесцветные коло¬нии, в бульоне — помутнение и слизистый осадок. В мазках, ок¬рашенных по Граму, обнаруживаются мелкие грамотрицательные формы. Они неподвижны, спор не образуют, в опре¬деленных условиях появляется видимая капсула.

Для быстрой идентификации бруцелл ставят реакцию агглю¬тинации со специфическими агглютинирующими сыворотками на стекле и определяют чувствительность к специфическому фагу. Все виды бруцелл не ферментируют углеводы. Их дифференци¬руют по образованию H2S, чувствительности к СО2, действию анилиновых красителей (основной фуксин).

Серодиагностика. Реакция агглютина¬ции Райта с бруцеллезным диагностикумом. Положительные ре¬зультаты отмечаются спустя 1 нед. после начала заболевания и сохраняются у переболевших многие годы. Диагностический титр реакции 1:200. Для ускоренной серодиагностики применяется реакция агглю¬тинации Хеддлсона, которая ставится с неразведенной сыворот-кой больного и концентрированным антигеном — диагностикумом, окрашенным метиленовым синим. При положительной реакции появляются хлопья си¬него цвета. Реакция положительна при наличии агглютинации на «++».

Для серодиагностики используют РПГА, РИФ, РСК, метод опреде¬ления неполных антител. В поздние периоды заболевания процент положительных серологических реакций (агглютинации, РПГА и РСК) начинает снижаться и большее диагностическое значение приобретают кожно-аллергическая проба и реакция Кумбса.

Биопроба. Применяется для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой. Исследуемый материал вводят морским свинкам подкожно в паховую область. Кусочки органов и лимфатических узлов засевают на питательные среды для получения чистой культуры и ее идентификации.

Кожно-аллергическая проба (реакция Бюрне). На предплечье внутрикожно вводят 0,1 мл бруцеллина. При наличии аллергии уже через 6 ч. могут появиться гипере¬мия кожи и болезненная отечность. Учет реакции производят через 24 ч. Реакция обладает высокой чувстви¬тельностью.

Лечение: Антибиотики широкого спектра действия. Специфическая иммунотерапия убитой лечебной бруцеллезной вакциной или бруцеллина (фильтрат бульонных культур В. melitensis, B.abortus, В.suis, убитых нагреванием . При острых формах – бруцеллезный иммуноглобулин.

Профилактика: Живая бруцеллезная вакцина получена штамма ВА-19А, полученную из В. abortus, создает перекрестный иммунитет против других видов бруцелл.

Накожная сухая живая бруцеллезная профилактическая вак¬цина. Взвесь вакцинного штамма. В. abortus применяется для профилактики бруцеллеза.

Билет № 15