Подготовка электрофореграмм к учету результатов способами денситометрии и фотометрии

Количественная обработка электрофореграмм состоит либо в элюции (извлечении) красителя из участков бумаги с располагающимися на них окрашенными белковыми фракциями с последующим фотометрическим измерением оптической плотности растворов, либо в непосредственной записи электрофореграмм с помощью денситометра — прибора, позволяющего регистрировать (сканировать) картину разделения фракций анализирующих веществ в отраженном или проходящем монохроматическом световом потоке.

Метод элюирования состоит в том, что сначала электрофореграммы разрезают по числу фракций, ориентируясь на самый светлый участок между ними. Каждую фракцию помещают в отдельную пробирку и заливают элюирующим раствором. К альбуминовой фракции добавляют двойной его объем, на основании чего величину оптической плотности для альбуминовой фракции умножают на два. Контролем служит участок фореграммы, не содержащий белка. Пробирки осторожно встряхивают и оставляют в затемненном месте на 30 минут (лучше 40мин — 1час).

Плотность испытываемых растворов определяют на фотометре любого типа с зеленым (красным) светофильтром. В качестве контрольного используют элюирующий раствор, по которому устанавливают «электрический нуль» прибора.

Состав элюирующих растворов, применяемых для извлечения красителя из окрашенных фракций электрофореграмм зависит от природы используемого индикатора. Для бромфенолового синего — 0,01н раствор гидроксида натрия (0,4 грамма гидроксида натрия в 1 литре дистиллированной воды).

При элюировании находят величину абсорбции каждой фракции и общую сумму значений оптической плотности, которую принимают за 100% или за величину содержания общего белка в сыворотке крови, представленную в размерности г/л. В первом случае результаты выражают в относительных, во втором — в абсолютных единицах. Последний способ оценки электрофореграмм более информативен.

Приняв сумму показателей оптической плотности отдельных элюатов за 100%, по простому тройному правилу рассчитывают относительное содержание альбумина и фракций глобулинов.

При денситометрии в проходящем свете предварительно обесцвечивают фон ацетатцеллюлозных пленок. Для просветления электрофореграмм применяют вазелиновое масло (для обесцвечивания фона бумажных лент). Для просветления материала ацетатных полос используют смесь пропилового спирта с ледяной уксусной кислотой и глицерином (85:12:3). Полосу пропитывают просветляющей жидкостью и располагают ее в перемещающем устройстве таким образом, чтобы против щели освещения находился неокрашенный участок. Записанная прибором кривая позволяет судить о числе фракций и содержании в них белка. С помощью интегрального устройства осуществляется количественная обработка картины разделения фракции белков, осуществляемая в автоматическом режиме. Количественную обработку денситограмм можно выполнить и ручным способом. Для этого кривую делят на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству красителя, соединившегося с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по массе вырезанных участков бумаги, определенной на торсионных весах. Общую массу принимают за 100% или же за содержание общего белка в плазме в г/л и вычисляют, какой % по отношению к нему составляет масса каждого участка (фракции).

Задача

Абсорбция фракции альбумина 0,52, альфа-1-глобулинов — 0,02, альфа-2-глобулинов — 0,05, бета-глобулинов — 0,1, гамма-глобулинов — 0,15. Рассчитать содержание белковых фракций в относительных и абсолютных единицах. Общее количество белка в сыворотке крови — 82 г/л, определите альбуминово-глобулиновый коэффициент, оцените результат исследования.

Сумма фракций = 0,84. Примем 0,84 за 100% и рассчитаем процентное содержание каждой фракции.

Альбумины — 61,9%

Альфа-1-глобулины — 2,4%

Альфа-2-глобулины — 5,9%

Бета-глобулины — 11,9 %

Гамма-глобулины — 17,9 %

Общее количество белка — 82 г/л. Примем 82 за 100% и рассчитаем количественное содержание каждой фракции.

Альбумины — 50,8 г/л

Альфа-1-глобулины — 2 г/л

Альфа-2-глобулины — 4,8 г/л

Бета-глобулины — 9,8 г/л

Гамма-глобулины — 14,6 г/л

Альбуминово-глобулиновый коэффициент = 0,52/0,32 = 1,6

Показатели альбумина, бета-глобулина, гамма-глобулина — в норме.

Показатели альфа-1-глобулина, альфа-2-глобулина — снижены.

Альбуминово-глобулиновый коэффициент — снижен.

Задача

Концентрация общего белка в сыворотке крови 59 г/л. Концентрация альбумина — 29 г/л. Рассчитать альбуминово-глобулиновый коэффициент. Оцените результат исследований, применяя терминологию. Расскажите принцип определения альбумина с БКЗ. Дайте характеристику альбумину и перечислите его основные функции.

Альбуминово-глобулиновый коэффициент = 29/30 = 0,97

Альбуминово-глобулиновый коэффициент снижен. Гипопротеинемия.

Определение альбумина в сыворотке крови

При взаимодействии альбумина с БКЗ (бром-крезоловым зеленым) образуется комплекс синего цвета интенсивность окраски которого прямо пропорциональна содержанию альбумина. Использование этого индикатора основывается на высоком сродстве его к альбумину при pH 7,0. Нормальное содержание альбумина в сыворотке крови — 30-50 г/л.

Альбумин выполняет три основные функции:

1. Создает коллоидно-осмотическое давление плазмы

2. Определяет онкотическое давление плазмы крови, от чего зависит объем крови в сосудистом русле и транспорт воды из него в более плотные ткани. В процессе голодания в первую очередь расходуется альбумин сыворотки крови, что приводит к резкому снижению онкотического давления, в результате происходит переход воды в ткани — онкотический отек.

3. Характерной особенностью сывороточного альбумина отличающей его от транспортных белков является свойство взаимодействовать с эндогенными и экзогенными соединениями. Эндогенные вещества с наибольшим сродством к альбумину — жирные кислоты и билирубин. Это обеспечивает высокую растворимость этих соединений в плазме крови. Экзогенные вещества — лекарственные соединения (антибиотики), которые связываясь с альбумином переносятся по всему организму.