Генетические дефекты синтеза белков

Исследование сыворотки крови на белковые фракции позволяет выявить генетические заболевания: нарушения синтеза некоторых белков.

Виды генетических дефектов:

1. Отсутствие альбумина при нормальном содержании других фракций белка. Этот вид наследственной патологии характеризуется отеками со снижением онкотического давления плазмы крови.

2. Агаммаглобулинемия — врожденный дефицит синтеза антител, входящих в гамма-глобулиновую фракцию. Общее количество белка при этом не изменено. Клинические проявления: повышенная восприимчивость к бактериальным инфекциям (ангина, отит и т. д.) при сохраненной сопротивляемости к вирусным инфекциям.

3. Гипоглобулинемия — общий недостаток глобулинов в сыворотке крови, при этом концентрация общего белка в сыворотке снижается до 40 г/л, а уровень альбумина остается в норме.

4. Абетаглобулинемия — это отсутствие бета-фракции на фореграмме, одновременно имеет место недостаток белка трансферрина, осуществляющего транспорт железа в организме человека.

Парапротеинемия

Это появление в крови белков, отличающихся в физическом, химическом, иммунологическим отношении от обычных белков сыворотки крови. Такие патологические белки представляют собой иммуноглобулины. Их называют парапротеинами (М-протеинами).

При проведении электрофореза белков сыворотки крови о наличии парапротеинов свидетельствуют появление на элекрофореграмме дополнительной (у здоровых людей отсутствует), узкой и резко ограниченной фракции белков (ее называют М-компонент) в области гамма-глобулинов.

Обнаружение парапротеинов характерно для хронических лейкозов — особой группы опухолей лимфатической системы. К парапротеинемическим гемобластозам относятся миеломная болезнь и болезнь Вальденстрема. Эти заболевания представляют собой костномозговую опухоль. По мере прогрессирования процесса появляются боли в позвоночнике, ребрах, обусловленные разрушением костей растущей опухолью. Резко повышена концентрация общего белка за счет аномальных белков. Уровень альбуминов при этом не изменен.

Парапротеины, проходя через почечный фильтр, попадают в мочу, где могут быть обнаружены, получив название белка Бенс-Джонса.

Проведение исследования на белковые фракции является лучшим методом ранней диагностики заболеваний с обнаружением парапротеинов у больных.

Основные требования к процессу проведения электрофореза

Электрофоретическая камера. В отделах камеры буферный раствор должен иметь одинаковый уровень. Концы полосок носителя (ацетатцеллюлозной пленки) не следует погружать в буферный раствор, в котором находятся электроды. Полоска носителя должна быть хорошо натянута и расположена горизонтально. В камере должна поддерживаться определенная влажность воздуха во избежание испарения буферного раствора в середине полосы и с краев ленты. Иначе в процессе электрофоретического разделения изменяются формы пятен фракций белков.

Подготовка к электрофорезу и процедура его проведения. Перед электрофорезом камеру устанавливают строго горизонтально. Кюветы заполняют буферным раствором так, чтобы уровень жидкости в них был одинаков. Полоски ацетатцеллюлозной пленки равномерно натягивают между кюветными отделениями. Сыворотку наносят на заранее отмеченные у катода участки полосы носителя.

Нанесение на полоску носителя биологического материала осуществляется с помощью аппликатора или микропипетки. Наносят 10 мкл (0,01 мл) свежеполученной (негемолизированной) сыворотки. Крышку камеры плотно закрывают и включают прибор.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови осуществляют при комнатной температуре. Оптимальное время электрофореза составляет обычно 20-40 мин (при электрофорезе на ацетатцеллюлозной пленке). По окончании электрофореза отключают источник постоянного тока, из камеры извлекают полоски ацетатцеллюлозной пленки, их не высушивают и далее обрабатывают влажными.

Для окраски электрофореграмм увлажненные буферным раствором ацетатцеллюлозные пленки кладут в развернутом виде на дно плоских эмалированных кювет и осторожно, медленно приливают красящий раствор. В процессе обработки реагентами электрофореграммы нельзя накладывать друг на друга и сворачивать.

Реактивы:

1. Буферные растворы. На электрофоретическое фракционирование белков большое влияние оказывает pH буферных растворов, состав и концентрация составляющих их реагентов, так как от кислотности (щелочности) среды буферной смеси зависит знак и величина электрического заряда молекул белков, а значит направление и скорость их движения. В качестве электролита чаще всего применяю веронал-мединаловый, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6.

2. Окрашивающие реагенты. Основным их компонентом являются индикаторы (бромфеноловый синий, кислотный сине-черный амидо черный 10В), представляющие собой красители, характерно связывающиеся с белком. Красители используют для выявления белковых фракций. Полоски в этих красителях выдерживают в течение 30 минут.

3. Отмывающие растворы. Для удаления не связавшегося с белком красителя электрофореграммы обрабатывает в нескольких (обычно 3-5) сменах отмывающего раствора до тех пор, пока фон лент не сделается светлым (белым), а промывная жидкость не перестанет окрашиваться в желтый цвет.

Состав отмывающего раствора во многом зависит от природы применявшегося для окрашивания белков индикатора. При окраске бромфеноловым синим используют раствор уксусной кислоты, получаемый добавлением к 20 мл ледяной уксусной кислоты 980 мл дистиллированной (или водопроводной) воды. Ленты, отмытые от избытка красителя, высушивают на воздухе при комнатой температуре (если в качестве индикатора использовался бромфеноловый синий, то в затемненном помещении).

Сухие окрашенные электрофореграммы хранят в темноте.