Иммуноферментный анализ (ифа)

В основе метода лежит способность ферментов без уменьшения активности присоединять белковые и небелковые вещества с образованием коньюгантов — определяемое вещество-фермент. Такие ферменты служат метками компонентов реакции.

В качестве индикаторных ферментных меток используются пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза и бета-галактозидаза. При действии фермента на хромоген образуется окрашенный продукт, о содержании которого судят по оптической плотности фотометрируемого раствора.

При реакции конкурентного типа антиген, меченный ферментом, конкурирует с немеченным исследуемым антигеном за содержащиеся на твердой фазе антитела. Таким образом, в этом варианте ферментативная активность обратно пропорциональная количеству антигена в исследуемом образце.

При реакции прямого типа антигены исследуемой биологической жидкости реагируют с иммобилизированными на твердой фазе антителами, после чего избыток смеси удаляют и в реакцию вводят антитела, меченые ферментом, которые связываются уже иммобилизованным антигеном. Ферментативная активность в этом случае прямо пропорциональна содержанию антигена в биологическом материале.

Твердофазный иммуноферментный анализ

Принцип состоит в формировании комплекса, напоминающего собой «слоеный пирог», в котором определяемое вещество составляет одни из внутренних слоев, а индикаторный фермент — самый внешний.

Определение выполняют в лунках, стенки которых изготовлены из специального синтетического материала, эффективно адсорбирующего антитела — полистирена.

Сначала в лунки вносят первичные антитела против определяемого вещества, а затем после их адсорбции на стенках и удаления избытка — исследуемую пробу, содержащую определяемое вещество.

Оно с помощью первичных антител фиксируется на стенках лунки. После этого добавляют вторичные антитела, фиксирующиеся на тех же молекулах определяемого вещества, которые другими группировками адсорбированы на первичных антителах (ELISA — метод двойных антител).

Четвертый слой иммунного «пирога» - фермент пероксидаза, фиксированный на антителах, связывающихся со вторичными антителами. При этом количество фиксированной пероксидазы оказывается прямо пропорциональным содержанию определяемого вещества в исследуемой пробе. После добавления каждого реагента и завершения реакции связывания избыток непрореагировавших белков тщательно удаляют отмыванием буферным раствором.

На конечном этапе определения проводят ферментативную реакцию. В лунку добавляют о-фенилендиамин или тетраметилбензидин и перекись водорода. Благодаря присутствующей пероксидазе о-фенилендиамин окисляется и через некоторое время интенсивность окраски измеряется фотометрически.

Учебная практика семестр 3

Техника безопасности

Инструкция при работе в биохимической лаборатории:

1. Работать в медицинском халате, шапочке, сменной обуви

2. Работать с исследуемым материалом в резиновых перчатках, все повреждения кожи на руках должны быть закрыты лейкопластырем. Избегать уколов и порезов.

3. Проводить разборку, мойку и ополаскивание лабораторной посуды, после предварительного дезинфицирования, в резиновых перчатках.

4. В случае попадания исследуемого материала на кожные покровы следует немедленно обработать в течение 2 минут тампоном обильно смоченным 70% спиртом, вымыть проточной водой и вытереть индивидуальным тампоном.

5. Для оказания первой помощи нужно воспользоваться аптечкой

6. После работы стеклянную лабораторную посуду моют с помощью ершей в мыльном растворе, в резиновых перчатках. Затем посуду необходимо прополоскать большим количеством воды и высушить в сушильном шкафу

7. После работы поверхности рабочих столов подвергаются дезинфекции. А при загрязнении столов во время работы, дезинфекцию нужно произвести немедленно!

8. Помещение, оборудование и лабораторная посуда должны содержатся в идеальной чистоте!

9. Влажная уборка помещения проводится не менее 1 раза в день, а при необходимости и чаще.

10. Один раз в месяц в помещении проводится генеральная уборка (стены, мебель, оборудование, пол).

11. При работе в лаборатории необходимо соблюдать тишину.

При работе с химическими реактивами

1. Проводить опыты только предусмотренные преподавателем, соблюдая правила безопасности

2. Быть осторожным при работе с концентрированными растворами кислот, щелочей, огнеопасными и ядовитыми веществами.

3. Наливать и насыпать реактивы только над столом. Пролитые или рассыпанные реактивы немедленно удалять по указанию преподавателя

4. Участки кожи или одежды, на которые попал реактив, промыть водой и нейтрализующим раствором.

5. Для проведения опыта брать вещества в указанных, по инструкции к лабораторной работе, количествах. Оставшиеся вещества не сливать и не ссыпать в сосуд, из которого они были взяты, а собрать в специальную тару.

6. При нагревании веществ (в водяной бане) пользуйтесь специальной тонкостенной термостойкой посудой.

7. По окончанию работы тщательно вымыть руки

Запрещается:

1. Есть, пить и пользоваться косметикой на рабочем месте в лаборатории

2. Пипетировать ртом. Следует использовать автоматические пипетки или резиновые груши.

3. Оставлять после работы грязную посуду, столы

4. Выполнять лабораторные работы без перчаток, халата и шапочки.

5. Оставлять без присмотра работающие приборы

6. Оставлять без присмотра работающие приборы

7. Оставлять и предавать реактивы в открытом виде

8. Пробовать вещества на вкус и вдыхать неизвестные вещества

9. Наклонять лицо над сосудом, в котором кипит, или налита какая-либо жидкость

10. Пользоваться реактивами без этикеток

11. Выполнять работы, не связанные с заданием и непредусмотренные инструкцией