Самостоятельная работа студентов
1. Знакомство студентов с защитной одеждой и правилами работы в бактериологической лаборатории.
Ознакомление с морфологией и тинкториальными свойствами (отношение к окраске по Граму) различных видов бактерий (микроскопия демонстрационных препаратов). Промикроскопировать, описать и зарисовать следующие микропрепараты:
Стафилококки (Staphylococcus aureus) – рис. 7. Грамположительные шаровидные микробы, располагающиеся в виде гроздьев винограда.
Кишечная палочка. (Esherichia coli) – рис. 8. Грамотрицательные палочковидные бактерии с закругленными концами, расположенные беспорядочно.
Стрептококки (Streptococcus pyogenes) - рис. 9. Грамположительные шаровидные микробы, располагающиеся в виде цепочек.
Вибрионы холеры (Vibrio cholerae) – рис.10. Грамотрицательные бактерии в виде запятых.
Стрептобациллы (Bacillus cereus) - рис.11. Окрашиваются по Граму положительно, имеют форму палочек, концы которых обрублены. Образуют цепочки, в теле микробной клетки могут быть видны неокрашенные участки спор. По морфологии напоминают возбудитель сибирской язвы. Препараты описать и зарисовать.
По окончании работы пробирки с культурами и демонстрационные мазки сдаются дежурным группы и возвращаются на лаборантский стол. Микроскопы ставят в нерабочее положение и сдают лаборанту кафедры. Воду из тазиков выливают в бак, рабочий стол протирают дезинфицирующим раствором. В конце занятия проводится дезинфекция и мытье рук. Тетрадь с записями и зарисовками, сделанными в ходе занятия, представляется преподавателю на подпись.
8. Знакомство с бактериоскопическим методом диагностики инфекционных болезней. Бактериоскопический метод основан на изучении морфологических и тинкториальных особенностей бактерий в препаратах, приготовленных из материала от больного. Метод широко используется в диагностике чумы, туберкулеза, гонореи, сифилиса и ряда других заболеваний.
Педиатрические аспекты темы
Значение медицинской микробиологии в практической деятельности врача-педиатра.
Тема 2. Морфология микроорганизмов. Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски бактерий. Окраска по граму. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов
Систематика и номенклатура микробов. Принципы классификации бактерий.
Различия и сходство свойств эукариотических и прокариотических клеток.
Морфология и ультраструктура бактерий.
Клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана бактерий, их структура и функции, особенности химического состава.
Состав и физиологическая роль цитоплазмы бактерий. Рибосомы, мезосомы, плазмиды. Бактериальный нуклеоид, его строение и функции. Цитоплазматические включения и способы их выявления.
Окраска по Граму
Информация к занятию Структура бактериальной клетки.
Бактериальная клетка состоит из оболочки или клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и цитоплазмы с нуклеоидом и включениями (рис. 13 – см. приложение). У отдельных видов бактерий имеются жгутики (органы движения), пили (реснички, фимбрии), капсулы, споры.
Оболочка обеспечивает форму бактерии, защищает ее от неблагоприятных внешних воздействий и высокого внутреннего осмотического давления. Она имеет многослойную структуру и сложный химический состав, отличающийся у грамположительных и грамотрицательных бактерий. В состав оболочек всех бактерий входит ригидный слой (пептидо-гликан), в состав которого входят уникальные вещества, не обнаруженные у других видов живых существ – D (правовращающие) аминокислоты, диаминопимелиновая кислота. У грамположительных бактерий клеточная стенка содержит особые тейхоевые кислоты, она толще и содержит меньше липидов, чем у грамотрицательных бактерий. Оболочка грамотрицательных бактерий содержит полипептидные и полисахаридные слои. Снаружи клеточной стенки расположен слизистый слой, который у ряда бактерий может набухать, увеличиваясь в размерах, образуя капсулу.
Цитоплазма бактерий может быть гомогенной, равномерно окрашивающейся, или содержать разнообразные включения органической и минеральной природы (включения волютина, фосфатов, серы, липидов и т.д.), выполняющие функции резервных веществ. Зерна волютина являются запасными питательными веществами и для некоторых видов бактерий (дифтерийная палочка) могут быть дифференциально-диагностическим признаком. Для выявления зерен волютина применяют специальный метод окраски по Нейссеру. Цитоплазма прокариотов покрыта цитоплазматической мембраной – аналогом митохондрий эукариотов, играющей жизненно важную роль в обменных (окислительно- восстановительных) реакциях у бактерий
При электронной микроскопии срезов бактериальной клетки в цитоплазме отчетливо видны клеточная стенка (оболочка), цитоплазматическая мембрана, нуклеоид (аналог ядра эукариотов), рибосомы и мезосомы – выпячивания внутреннего слоя цитоплазматической мембраны (рис. 2). Мезосомы принимают участие в делении бактерий и создании их оболочки.
Величина бактерий измеряется в микрометрах. Большинство кокков имеют диаметр около 0,5—1 мкм, у палочковидных форм поперечный размер составляет 0,5— 2 мкм, а длина варьирует в широких пределах. Длинные формы (до 500 мкм) могут наблюдаться среди спирохет.
Среди сложных методов окраски микроорганизмов широкое распространение получил метод Грама (обычно в модификации Синева), имеющий большое дифференциально-диагностическое значение в бактериологии.
|
Рис. 2. Электронограмма B.subtilis. N – нуклеоид, P.C. - клеточная стенка M.C.- цитоплазматическая мембрана, M - мезозома, S – растущая поперечная перегородка |
Техника окраски по Граму.
карболовый генциан-виолет – 1 - 2 мин. (на полоски фильтровальной бумаги, пропитанные раствором генциан-виолета и высушенные, наносят несколько капель воды);
краску сливают, не промывая водой, наносят раствор Люголя на 1 мин. При этом мазок чернеет;
раствор Люголя сливают, обрабатывают препарат спиртом в течение 30 сек., слегка покачивая мазок (до прекращения отхождения лиловых струек);
немедленно промывают мазок водой;
докрашивают препарат водным фуксином в течение 1 - 2 мин;
мазок промывают, высушивают, микроскопируют.
Способность бактерий различно окрашиваться по методу Грама, обусловлена различиями структуры и химического состава бактериальной клетки, прежде всего, оболочки. В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы — грамположительные и грамотрицательные.
Грамположительные (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus и др.) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, т.к. их оболочечные структуры связывают и прочно удерживают комплекс генциан-виолета с йодом, не обесцвечивающийся спиртом. Грамотрицательные бактерии (Escherichia coli) окрашиваются в светло-красный цвет, поскольку их оболочка неспособна формировать и удерживать комплекс генциан-виолета с йодом, легко обесцвечиваясь спиртом (рис. 12).
При окраске бактерий по методу Грама необходимо учитывать следующие обстоятельства:
возраст культуры имеет существенное значение, так как в "старых" культурах тинкториальные свойства бактерий могут быть изменены;
мазок должен быть тонким и равномерным;
не рекомендуется подвергать препарат форсированной горячей сушке;
окрашивать можно лишь полностью остывший препарат.