Реакции иммунитета (серологические реакции).

В связи с высокой специфичностью и чувствительностью реакции взаимодействия анти­гена и соответствующего ему антитела эти реакции широко применяются для лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Серологические реакции применяют в двух направлениях:

1) для выявления антител в сыворотке больного с помощью известного антигена (серологический метод диагностики инфекционного заболевания;

2) для определения вида или серовара микроорганизма при его идентификации с помощью известного антитела.

В зависимости от свойств антигена и особенностей среды, в которой взаимодействуют антигены и антитела, различают реакцию агглютинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента, нейтрализации и др.

Реакции агглютинации (РА) - склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток под действием антител в присутствии солей (обычно используется изотонический раствор хлорида натрия). Определяемые антитела (агглютинины) находятся либо в сыворотке крови больного человека либо иммунного животного; антигеном является взвесь убитых или живых микроорганизмов.

Для получения сыворотки кровь у человека берут обычно из вены, собирают в стерильную пробирку, оставляют на час при комнатной температуре или при 37⁰ С на 30 мин. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки стеклянной палочкой, пробирку оставляют в холодильнике на ночь для лучшего отделения сыворотки. На следующий день сыворотку отсасывают, при необходимости освобождают от форменных элементов крови центрифугированием.

Иммунные диагностические сыворотки, содержащие антитела к определенному антигену, получают чаще из крови кроликов или лошадей, многократно иммунизированных соответствующим антигеном (взвесь живых или убитых микроорганизмов, анатоксины, экстракты клеток и тканей, эритроциты и т. п.). Нередко такие сыворотки, содержат групповые антитела, агглютинируя родственные между собой микробные виды, содержащие общий групповой антиген. Групповая агглютинация затрудняет определение вида выделенного микроба. Устраняют групповую агглютинацию путем смешивания сыворотки с густой взвесью микробов, дающих групповую агглютинацию, что приводит к адсорбции на их поверхности соответствующих антител (метод Кастеллани). В жидкости, полученной после центрифугирования, остаются антитела лишь в отношении гомологичного микроба или его антигена. Полученная сыворотка является строго специфичной и называется адсорбированной (типовой, монорецепторной).

Для определения антител в крови больного человека можно использовать живые культуры микроорганизмов, однако чаще используются взвеси убитых микроорганизмов (диагностикумы). Реакция агглютинации ставится в 2 вариантах: ориентировочная реакции на стекле и развернутая реакция в пробирках.

Для постановки ориентировочной реакции агглютинации на предметное стекло наносят по 2 капли известной сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора вносят петлей культуру исследуемого микроорганизма, тщательно перемешивают и через 1-3 минуты учитывают реакцию. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контрольной. Реакция считается положительной в том случае, когда в капле, где культура смешана с сывороткой, выпадают хлопья агглютината, контроль сыворотки остается прозрачным, а в контроле антигена отмечается равномерное помутнение (рис.35, см. приложение).

Постановка развернутой реакции агглютинации предполагает приготовление разведений (обычно двукратных в объеме 1,0 мл) известной диагностической или исследуемой от больного человека сыворотки, в которые добавляют 0,1 мл (2 капли) живых или убитых микроорганизмов. В качестве двух контролей используют сыворотку в максимальной концентрации (антиген в нее не вносят), а также изотонический раствор хлорида натрия, в который вносят антиген. Положительная реакция характеризуется выпадением на дно пробирок хлопьевидного или зернистого осадка в виде зонтика, жидкость над осадком при этом просветляется. При встряхивании осадка (агглютината) видны хлопья, плавающие в прозрачной жидкости. В контроле антигена наблюдается осадок в виде пуговки (при встряхивании - равномерное помутнение), в контроле сыворотки – полная прозрачность (рис. 12).

Рис. 12. Развернутая реакция агглютинации

В практической работе нередко ставят РА по типу Видаля, основывающейся на обнаружении агглютининов (антител) в сыворотке крови больных. Эта реакция используется с целью подтверждения инфекционной болезни, вызванной тем или иным возбудителем: для диагностики брюшного тифа (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция с риккетсиями Провачека), бруцеллеза (реакция Райта и Хеддельсона), туляремии и других заболеваний. Реакцию проводят на второй неделе заболевания, когда в крови накапливается достаточно высокий титр антител к возбудителю.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) - агглютинация эритроцитов, нагруженных антигеном или антителом, под влиянием специфических антител или антигенов с целью определения неизвестных антител или антигенов (рис. 13, рис. 34, см. приложение). Реакцию ставят в специальных полистироловых планшетах (обычно в двукратных разведениях сыворотки или материала, содержащего антиген, объемом 0,2 мл), добавляют соответствующий антигенный или антительный эритроцитарный диагностикум, выдерживают в термостате при 370 С или при комнатной температуре 2 часа, учет производят сразу после этого или на следующий день. Контролем служит взвесь эритроцитов с заведомо иммунной и нормальной сыворотками. В первом случае должна произойти агглютинация, во втором ее не должно быть. Контролем антигена служит взвесь нормальных эритроцитов, к которым добавлена испытуемая сыворотка, а также раствор хлорида натрия, к которому добавляют эритроцитарный диагностикум (в обоих контролях не должно быть агглютинации).

Рис. 13. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации - РНГА

Реакция латекс-агглютинации – агглютинация частиц полистирольного латекса, нагруженных антигенами или антителами, в присутствии соответственно антител или антигенов.

Реакция угольной агломерации (РУА) выполняется аналогично реакции латекс-агглютинации, однако вместо частиц полистирольного латекса используют мелкодисперный уголь с адсорбированными на нем специфическими моноклональными антителами.

Реакция коагглютинации основана на способности белка А золотистого стафилококка вступать в реакцию с Fc-фрагментом иммуноглобулина G. Fab фрагменты IgG, обладающие функцией антител за счет активных центров, вступают в специфическую реакцию с гомологичным антигеном, вызывая агглютинацию стафилококка.

Опсонофагоцитарная проба. Опсонины представляют собой сывороточные белки (антитела, компоненты комплемента и др.), усиливающие фагоцитоз. Опсоно-фагоцитарную ставят при бруцеллезе, сыпном тифе и других болезнях. Учитывают реакцию по данным определения фагоцитарного показателя (среднее количество микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом при подсчете в мазке не менее 100 фагоцитов), опсонического индекса (ОИ - отношение фагоцитарного показателя иммунной сыворотки к фагоцитарному показателю нормальной сыворотки), опсоно-фагоцитарного индекса (ОФИ) и титра опсонинов (ТО).

Для определения ОИ исследуемый и контрольный образцы крови инкубируют 15 мин в смеси со стандартным количеством тест частиц (микроорганизмы, грибы, латекс). Из каждой пробы готовят мазки, фиксируют их жидким фиксатором, окрашивают метиленовой синькой или по Романовскому-Гимза. Подсчитывают число фагоцитарных частиц в 100 фагоцитах, находят фагоцитарные числа обеих проб и устанавливают ОИ.

ОФИ, в отличие от ОИ, отражает состояние и изменение опсонических свойств, вызванные антителами и комплементом, и фагоцитарной активности лейкоцитов больного к специфическому возбудителю. Методика постановки и учета ОФИ при разных заболеваниях различна (визуальная, культуральная, изотопная). При визуальном варианте в пробирку с 0,25 мл 2% раствора цитрата натрия добавляют 0,5 мл крови больного и 0,25 мл гретой суточной агаровой культуры возбудителя заболевания плотностью 1 млрд/мл (по кишечному стандарту). Смесь инкубируют 30 мин при 37°, а затем поступают так, как при определении ОИ.

Титр опсонинов (ТО) количественно характеризует силу опсонической активности по отношению к специфическому возбудителю. В отличие от ОФИ здесь исключается влияние изменений со стороны фагоцитов, т.к. в опыт берут лейкоциты или макрофаги здорового человека.