Самостоятельная работа студентов

Микрофлора кожи (окончание). а) Изучение ха­рактера роста микробов на среде Кесслера. Приготовление мазка со среды Кесслера и окраска его по Граму. б) Учет характера роста на чашках со средой Левина (посев мазков-отпечатков кожи пальцев был произведен на предыдущем занятии). Сделать вывод о качественном составе микрофлоры кожи рук.

1. Микрофлора почвы (демонстрация).

а) Определение общего микробного числа почвы. Навеску почвы (30 г), вносят в колбу с водой объемом 270 мл, готовят разведения 10^-3, 10^-4, 10^-5, смешивают по 0,1 мл указанных разведений суспензии почвы с 40 мл расплавленного и остуженного до 40⁰С MПA, затем выливают вторым слоем в чашки Петри с 2% МПА. Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 часов, после чего определяют количество выросших на чашке колоний;

б) Определение перфрингенс-титра почвы при посеве ее различных разведений на молоко или среду Вильсона-Блера (агар с глюкозой, хлоридом железа и сульфитом натрия). Учет результатов проводят по свертыванию молока или образованию черных колоний Cl. perfringens через 48 часов на среде Вильсона-Блера. Демонстрацию описать, зарисовать.

2. Микрофлора воды (демонстрация).

а). Определение микробного числа водопроводной воды. Произведен посев 1 мл воды на чашку с МПА. Подсчитать количество выросших колоний - микробное число воды.

б) определение коли-титра и коли-индекса водопроводной воды бродильным мeтодом (демонстрация). Методика: водопроводная вода в количестве 333 мл (3 объема по 100,0 мл; 3 объема по 10,0 мл; 3 объема по 1,0 мл) засевается на глюкозо-пептонную среду. Посевы инкубируют в термостате при 37⁰ С 24 часа. Из всех проб, где произошел рост с помутнением, кислото- и газообразованием производят высев на чашки Петри со средой Эндо. Чашки инкубируют в термостате при 37⁰ С 16-18 часов. Учет результатов производят по наличию типичных колоний (окрашенных в ярко-розовый цвет лактозопозитивных), морфологии микроорганизмов из этих колоний (грамотрицательные палочки) и определению оксидазы путем посева колоний на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-парафенилдиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительной она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. Кишечная палочка оксидазной активностью не обладает. Грам-отрицательные палочки, не образующие оксидазу, пересевают в полужидкий глюкозный питательный агар, инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 часов. Расчет коли-титра и коли-индекса осуществляется по специальным таблицам (пример табл. 13).

б) определение коли-титра и коли-индекса методом мембранных фильтров (демонстрация). Методика: мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Мембранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Исследуемую воду фильтруют в объеме 500,0 мл. Затем фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашку Петри и после инкубации при 37⁰ С в течении суток подсчитывают количество колоний красного цвета на фильтре. Колонии красного цвета переносят на фильтровальный диск, смоченный диметил-парафенилдиамином для определения оксидазной активности. При наличии оксидазы колонии окрашиваются в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, пересевают в полужидкий глюкозный питательный агар, инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 часов. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Количество положительных результатов			Коли-индекс	Пределы индекса		Коли-титр
Из 3 объемов по 100 мл	Из 3 объемов по 10 мл	Из 3 объемов по 1 мл		Нижний	верхний
0	0	0	Менее 3	-	-	Более 3300
0	0	1	3	0,5	9	333
0	1	0	3	0.5	13	333
1	0	1	4	0.5	20	250
…	…	…	7	1	21	143
…	…	…	…	…	…	…
3	3	2	1100	150	4800	0,9
3	3	2	Более 1100	-	-	Менее 0,9

Таблица 13. Определение коли-индекса и коли-титра при исследовании воды

Нормативы для питьевой воды - число микробов в 1 мл – не более 50 клеток, коли-индекс (количество кишечных палочек в 1 литре воды) - не более 2. Коли-титр - количество воды, в котором находится 1 кишечная палочка) – 500.

3. Микрофлора воздуха. Санитарно-бактериологический анализ воздуха лаборатории. Определяют микробное число аспирационным методом с помощью аппарата Кротова и количество санитарно-показательных микробов. Для определения общего числа микробов скорость просасывания должна быть 25 л/мин. с экспозицией 4-5 мин.; для обнаружения стафилококков - используется желточно-солевой или кровяной агар, длительность экспозиции составляет 10-15 минут. Количество выросших колоний пересчитывают на 1 м³ воздуха.

4. Анализ микробной загрязненности рабочих столов и посуды (выявление наличия кишечной палочки на руках сотрудников аптек). Исследование смывов с рук. Методика: стерильный тампон смачивают в среде Кесслера (пептонная вода с лактозой, желчью и генциан-вио­летом). Этим тампоном делают смывы с обеих рук, протирая ладони, межпальцевые промежутки и подногтевые пространства. Тампоны, которыми производились смывы, помещают в среду Кесслера. Инкубация в термостате при 37⁰ С 24 часа. Производится оценка характера роста Е. coli на средах Булира, Кесслера, Эндо и золотистого стафилококка на желточно-солевом и кровяном МПА.

5. Микрофлора пищевых продуктов (демонстрация – на примере оценки санитарно-бактериологического состояния молока и молочных продуктов ). Качество молока и молочных продуктов оценивается по присутствию мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАМ) и присутствию бактерий группы кишечной палочки (БГКП).

- определение МАФАМ (демонстрация). Молоко разводят стериль­ным физиологическим раствором в разведениях 1:10,1:100, 1:1000. По 1,0 мл каждого разведения расплавленного и остуженного до 40⁰С MПA засевают на дно чашки Петри с МПА, инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 часов, затем подсчитывают количество выросших колоний.

- определение БГКП (демонстрация). Цельное пастеризованное молоко засевают в 6 пробирок со средой Кесслера (в 3 пробирки – по 1 мл, в остальные - по 0,1 мл). Посевы инкубируют при 43⁰С в течение 1 суток, после чего из проросших сред делают посевы на среду Эндо и инкубируют при 37⁰С в течение суток. Из выросших красных колоний готовят мазки в окраске по Граму, микроскопируют и делают посевы на среду Козера (дистиллированная вода, фосфат натрия-аммония, фосфат калия однозамещенного, сульфат магния, цитрат калия) и в пептонную воду с глюкозой, культивируя соответственно при 37⁰С и 43⁰С в течение 18-24 часов. Учет производят по расщеплению глюкозы с образованием кислоты и газа при отсутствии роста на цитратной среде Козера. Аналогично исследуют сливки, молочно-кислые продукты, мороженое.

Провести учет ре­зультатов демонстрационного опыта по определению МАФАМ и БГКП.

в) Обнаружение патогенных бактерий (де­монстрация). Произведен посев различных разведений молока на желточно-солевой агар, среду Левина, кровяной МПА. Определить на­личие патогенных бактерий. Сделать вывод. Результаты записать.