Самостоятельная работа студентов

1. Опыт по выявлению действия низких концентраций фенола на подвижность бактерий (модификационная изменчивость). Подвижную культуру P.vulgaris засевают по методу Шукевича на скошенный агар с добавлением 1% фенола. Через сутки инкубации в термостате при 37⁰С выполняют пересев по методу Щукевича на скошенный агар. Демонстрация: среда № 1 - посев исходной культуры протея. Наблюдается ползучий рост по всей скошенной поверхности - культура подвижна. Среда № 2 - с добавлением фенола - рост только в точке нанесения культуры (культура неподвижна). Среда № 3 - пересев со среды с фенолом на среду без фенола - рост по всей скошенной поверхности (культура подвижна). Произошла реверсия признака. Делается вывод о модификационном характере изменчивости протея.

2. Изучение характера роста S (E.coli) и R (B. cereus) форм бактерий на плотной и жидкой питательных средах (демонстрация).

3. Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения (демонстрация). Объект облучают при красном свете бактерицидной лампой ВУФ-15 на расстоянии 60 см от его центра.

Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, устанавливая оптимальную мутагенную дозу (0,1—1 % от числа выживших бактерий).

Для получения lac-мутантов Е.coli испытуемую культуру, содержащую 2х 10⁸ бактерий в 1 мл среды, выращивают в питательном бульоне в течение 14—18 ч. Бактерии осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль 1 л раствора MgSО₄ и охлаждают во льду (для прекращения деления клеток). Затем суспензию в объеме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15—150 сек., после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме питательного бульона и инкубируют при 37⁰ С в течение 14—18 часов. Затем из разведения 10²—10⁵ по 0,1 мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Например, ампициллин—10 мкг/мл, левомицетин— 5 мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл.

На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные ко­лонии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концент­рацией антибиотика, являются к нему резистентными. Параллельно делают контрольные посевы.

4. Опыт трансформации (демонстрация). Реципиентом является стрептомициночувствительный штамм кишечной палочки - Escherichia coli Str^s , донором - ДНК, выделенная из штамма Escherichia coli Str^r , устойчивого к стрептомицину. Селективной средой для отбора рекомбинантов служит питательный агар со стрептомицином (100 ЕД/мл).

К 1 мл бульонной культуры E.coli добавляют 1 мкг/мл ДНК донора, смесь инкубируют при 37⁰ С в течение 30 мин, после чего в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы (для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма), и вновь инкубируют в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10^–5 – 10^-6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. Посев инкубируют при 37⁰ С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма. На среде со стрептомицином реципиентная культура не должна расти, т.к. она чувствительна к стрептомицину. Частота трансформации определяется отношением количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма .

5. Опыт специфической трансдукции (демонстрация). Реципиентом является штамм Е. coli lac^-, лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг—фаг λ dgal, часть генов которого замещена дефектным β -галактозидазным опероном Е. сoli, неспособным вызывать лизис кишечной палочки. На селективной среде Эндо лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного - красные колонии с металлическим блеском.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага λ dgal (концентрация 10⁶—10⁷ бактерий в 1 мл). Смесь инкубируют при 37⁰ С в течение 60 мин, затем готовят ряд десятикратных разведении. Из пробирки с разведением 10⁶ делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма. Частота трансдукции определяется отношением числа клеток рекомбинантов к числу клеток реципиентного штамма.

6. Опыт конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина (демонстрация). Донор — штамм Е. coli K12 Hfr leu⁺ Str^s. Реципиент—штамм E. Coli K12F^- leu^- Str^r. Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином. К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение 30 мин, затем смесь разводят до 10^–2 – 10^-3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают штаммы донора и реципиента, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а ТОрой ауксотрофен по лейцину. Культуру донорского штамма высевают также на селектив­ную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма—на полную среду (питательный агар с антибиотиками) для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 37⁰ С. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

7. Учет ПЦР при уреаплазмозе (демонстрация, рис. 10).

5 Клиническая проба	4 Отрицательная проба	3 Mycoplasma genitalis	2 Ureaplasma urealyticum	1 Mycoplasma hominis	0 Длина нук­леотидных пар
					2205
					2027
					977
					856
					810
					501
					458
					125
Рис. 10. Разделение в агарозном геле продуктов амплификации фрагментов генов микоплазм. 0 –длина нуклеотидных пар, 1 – Mycoplasma hominis – положительный контроль, 2 – Ureaplasma urealyticum – положительный контроль, 3 Mycoplasma genitalis –– положительный контроль, 4 ––отрицательный контроль, 5 – клиническая проба, положительная на Ureaplasma urealyticum