2. Знакомство с методами асептики, антисептики, дезинфекции и стерилизации.

В протоколах в соответствии с таблицей 2 отразить способы и режимы стерилизации лабора­торной посуды, простых питательных сред, а также сред, содержащих углеводы и нативный белок.

3. Знакомство с бактериологическим методом диагностики инфекционных болезней. Этот метод заключается в выделении чистой культуры болезнетворного микроорганизма и его идентификации, позволяя подтвердить диагноз многих инфекционных болезней. Установление причины инфекции позволяет обоснованно назначить лечение больному и провести адекватные противоэпидемические мероприятия.

4. Характер роста лактозоположительных и лактозоотрицательных бактерий кишечной группы на средах Плоскирева, Левина, Эндо, МПА (демонстрация, рис. 24, см. приложение). Обратить внимание на цвет колоний. Резуль­таты занести в рабочую тетрадь.

5. Выделение чистой культуры аэробов из материала от возможного носителя стафилококка (самостоятельная работа).

Самостоятельная работа студентов заключается в обследовании друг друга на носительство золотистого стафилококка. Произвести посев материала со слизистой оболочки носа, взятой стерильным ватным тампоном, на поверхность пластинчатого МПА. При посеве максимально использовать площадь сектора питательной среды. Дно чашки Петри подписать карандашом по стеклу и сдать дежурному. Работа по выделению чистой культуры будет продолжена на следующем занятии. Выделение чистой культуры аэробов документируется по следующей форме:

Протокол № I Выделение чистой культуры аэробов со слизистой оболочки носа от потенциального носителя золотистого стафилококка

День исследования

Ход исследования

Результат исследования

Тема 5. Физиология бактерий. Дыхание и размножение бактерий. Методы культивирования аэробов и анаэробов Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Рост и размножение бактерий.

2. Дыхание микроорганизмов, классификация бактерий по способу дыхания.

3. Механизмы аэробного и анаэробного способов дыхания.

4. Характеристика роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.

5. Методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Информация к занятию Рост и размножение микроорганизмов.

Рост бактерий - это увеличение количества, массы и размеров всех микробной клетки, начинающийся сразу после ее деления. Рост неразрывно связан с размножением.

Размножение у бактерий – процесс самовоспроизведения микробной клетки. Он начинается с разделения ДНК нуклеоида на две дочерние нити, каждая из которых затем достраивается комплементарной нитью, при этом одновременно происходит образование двух дочерних клеток (полуконсервативный способ). Бактерии размножаются поперечным делением с резким увеличением количества клеток в популяции, процесс повторяется через одинаковые промежутки времени (от нескольких минут до нескольких суток), являясь индивидуальной генетической характеристикой микробного вида. При делении могут образовываться либо две одинаковые клетки, либо две асимметричные (полиморфные).

Бактерии отличаются высоким темпом размножения на различных питательных средах, который характеризуется временем генерации. Это время между двумя делениями клетки, проходящее от момента появления клетки до момента деления (например, время генерации кишечной палочки - 20 мин, возбудителя туберкулеза - 14 час). Скорость размножения зависит от вида бактерий и условий культивирования (химического состава питательной среды, её агрегатного состояния, рН, температуры, аэрации, газового состава, наличия питательных веществ и стимуляторов роста и т. д.). При размножении бактерий на плотных питательных средах, они образуют колонии - потомство одной клетки, визуально определяемое на (или в) питательной среде. Изолированные колонии являются скоплениями микробов одного вида, и, как правило, одного клона.

Внешний вид колоний у некоторых бактерий может быть весьма своеобразным, являясь типичным для некоторых микроорганизмов. Так, например, колонии возбудителя сибирской язвы сравнивают с «гривой льва» или «головой медузы», колонии возбудителя чумы похожи на «кружевной платок» и т.д.

Для характеристики колоний, растущих на питательных средах, применяется ряд стандартных параметров - макроскопическая характеристика.

По форме колонии бывают правильные — округлые, или неправильные - амебовидные и ризоидные, напоминающие переплетающиеся корни деревьев. В зависимости от размеров выделяют колонии точечные (диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр I — 2 мм), средние (диаметр 2 — 4 мм) и крупные (диаметр 4 — 6 мм и более).

Цвет определяется видом пигмента (белый, желтый, красный и др. – рис 25 - приложение). Пигментированные колонии, например, встречаются у стафилокока (белый, лимонно-жёлтый или золотистый), у сарцин цвет пигмента жёлтый, у бактерий рода Serratia красный, у дрожжеподобных грибов Candida albicans белый. Многие патогенные бактерии пигмента не образуют - их колонии прозрачные или опалесцирующие.

По консистенции колонии бактерий чаще бывают мягкие, слизистые или плотные, крошковидные. По характеру краев различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные — фестончатые и волнистые. Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth - гладкие), шероховатые буквой R (rough - шероховатый).

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается последовательная смена отдельных фаз в размножении бактериальной популяции (рис. 9):

1. Начальная фаза (лаг-фаза). Размножения клеток не происходит; микробы адаптируются к питательной среде, увеличиваются в размерах, накапливают ферменты, начинается репликация ДНК. В конце фазы начинается медленное размножение микробов.

2. Экспоненциальная фаза (лог-фаза) характеризуется максимальной скоростью размножения, при этом число бактерий увеличивается в геометрической прогрессии.

3. Стационарная фаза, при которой наблюдается равновесие между количеством вновь образовавшихся клеток и количеством погибших.

4. Фаза отмирания. В эту фазу происходит гибель клеток.

Величину биомассы определяют по ее сухой массе, а также содержанию бактериального азота, белка, ДНК, фосфора.

Рис. 9. Кривая роста бактериальной культуры. По оси абсцисс – количество бактерий, по оси ординат - время

Общее количество бактериальных клеток исследуют в счетных камерах, окрашенных мазках или по измерению светорассеяния.

В счетных камерах (например, Горяева) подсчитывают не менее 600 клеток в 10 большых квадратах, затем вычисляют среднее количество клеток в одном большом квадрате и рассчитывают концентрацию клеток в суспензии по формуле:

где X – число клеток в 1 мл суспензии, α – число клеток в одном большом квадрате, b – разведение.

При подсчете бактерий в окрашенных мазках микропипеткой наносят 0,01 мл бактериальной взвеси, площадью около 1 см² , мазок фиксируют, окрашивают, микроскопируют. Общее количество бактерий в 0,01 мл равняется числу клеток в поле зрения микроскопа, деленному на площадь зрения в квадратных см, вычисленную методом микрометрии.

Измерение светорассеяния основано на принципе пропорциональности количества света, рассеиваемого бактериальными клетками, к их концентрацией. На практике используют простой метод сравнения помутнения исследуемой бактериальной взвеси с известными по концентрации стандартами мутности, а также объективные нефелометрические методы с использованием фотоэлектроколориметров.

Подсчет живых бактерий осуществляется путем количественного посева бактерий на питательные среды с последующим подсчетом количества колоний. Для этого посевной материал равномерно распределяют по поверхности хорошо высушенного питательного агара. Можно также посевной материал сначала смешать с расплавленным агаром, а затем разлить (либо в пустые чашки, либо на поверхность застывшего питательного агара в чашке Петри).

Микроорганизмы по условиям температурного культивирования подразделяются на 3 группы:

• Психрофилы (рост в пределах от - 6⁰ до +35⁰С, оптимум 10-20⁰С);

• Мезофилы, живущие в диапазоне температур от 3⁰ до 45-50⁰С (оптимум 30-37⁰С);

• Термофилы (диапазон температур от 28-35⁰ до 70-80⁰С, оптимум 50-60⁰С).