3.Основные методы исследования морфологии бактерий. Микроскопия. Методы окраски микробов и их отдельных структур.

• микроскопический метод: световая, фазово-контрастная, флуоресцентная, электронная;

• культуральный метод (бактериологический, вирусологический);

• биологический метод (заражение лабораторных животных);

• молекулярно-генетический метод (ПЦР - полимеразная цепная реакция)

• серологический метод - выявления антигенов микроорганизмов или антител к ним;

Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств. При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры.

Виды микроскопов:

• световой с иммерсионной системой (всегда используется иммерсионное (кедровое) масло для повыш разрешающей способности)

• темнопольный (дифракция света при сильном боковом освещении, поле зрение темное, от м/о отражаются лучи-> «звезды на темном небе»; для изуч подвижности бактерий)

• фазово-контрастный (поле зрение –светлое, объекы- темные)

• люминесцентный (некот в-ва светятся зеленым под действием коротковолнового излучения; для обнаружения патогенных бактерий в материале)

• современный электронный (состоит из колонны, через которую в вакуум проходят е, испускаемые катодной нитью. Поток е фокусируется магнитами, а затем проходит через ультратонкий образец и фиксируется на экране)

Специальные методы окраски бактерий

Наибольшее распространение нашли методы окраски Грама и Циля-Нильсена

По Граму: 1.карболовый генциан виолет 2 мин. 2.Промыть водой. 3.Люголь 1 мин. 4.промыть водой. 5.Спирт 30 сек. 6.вода. 7. водный фуксин 2 мин. 8.вода.

По Цилю: карболовый фуксин до появления паров. 2.Дать остыть. 3.Обесцветить 1% серной кислотой 30 сек. 4.вода 5.Метиленовая синька 5 мин. 6.вода

Дифференцирующие методы окрашивания обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур. Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лёйфсона и Антони; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuS04.Для окраски жгутиков бактерий предложены методы Лёффлера, Бёйли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля). Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в розовый.

4. Морфология, ультраструктура и химический состав бактерий. Субклеточные формы бактерий: протопласты, сферопласты, l-формы бактерий.

  По форме выделяют следующие основные группы микроорганизмов: Шаровидные или кокки, Палочковидные, Извитые, Нитевидные.

   Кокковидные:  

• Микрококки расположены в одиночку  

• Диплококки- гонококк, менингококк, пневмококк.

• Стрептококки. образуют цепочки.

• Тетракокки. Деление в двух взаимоперпендикулярных плоскостях  (непатогенные)

• Сарцины. Деление в трех взаимоперпендикулярных плоскостях

• Стафилококки напоминают грозди винограда. Хаотичное деление

   Палочковидные (самая крупная группа)

• Бактерии- палочки, не образующие спор (большинство)

• Бациллы- аэробные спорообразующие микробы.  

• Клостридии- анаэробные спорообразующие микробы

      Извитые 

• Вибрионы один изгиб.  

• Спириллы- имеют 2- 3 завитка

• Спирохеты- имеют различное число завитков.

Ультраструктура

1.капсула защитная полипептидная или полисахаридная оболочка.Содержит много воды. Функции – защитная, антигенная, запас веществ, адгезия. Бывает микро и макрокапсула. Окраска по Бури-Гинсу.

2.Жгутики – необязательные белковые, из сократительного белка флагеллина.( монотрих, лофотрих, амфитрих,перитрих). Трудно окрашивается, серебрение по Морозову

3.Пили – микроворсинки, белковые трубочки на поверхности для адгезии и конъюгации.

4.Клеточная стенка – обязательный элемент бактерии. Функции: форма, защита, транспорт, антигены у грамм+, спорообразование. Окраска по Граму, ЛПС- эндотоксин у грамм -, мишень для аб.

Каркас- петидогликан(муреин): его основа- дисахарид из N-ацетилглюказамина и N-ацетилмурановой к-ты.

Стенка грамположительных бактерий после окраски по Граму сохраняет комплекс йода с генциановым фиолетовым (окрашены в сине- фиолетовый цвет), грамотрицательные бактерии теряют этот комплекс и соответствующий цвет после обработки и окрашены в розовый цвет за счет докрашивания фуксином.

 

Грам+	Грам-
Петидогликан многослойный (80-90%), связан с тейхоевыми и липотейхоевыми к-тами (АГ), нет пор Нет ЛПС фиолетовый	Пептидогликан однослоен 10-20%, много пор, нет тейхоевых к-т, есть ДАП (диаминопимелиновая к-та) Снаружи ЛПС красный

5. Цитоплазматическая мембрана. 3х слойная. Защитная, транспортная, спорообраз ф-ции, участие в делении

6.Цитоплазма

7. Мезосомы – выросты цитоплазматической мембраны – деление, связаны с нуклеоидом, локализ Е-ферменты

8. Рибосомы РНК+белок 30S и 50S, перед синтезом объед в 70S. Не объединены в ЭПС. Мб мишенью для аб. Синтез белков

9.Нуклеоид.(ДНК 2нитевая молекула, нет ядер оболочки, ядрышек, гистоновых белков. Гаплоидны)

10.Плазмиды – изолированные фрагменты ДНК. Хранение и передача

11.Включения продукты метаболизма, запас пит в-ва. Гликоген, крахмал сера, жиры (дифтерия- волютин. Ps окраска по нейссеру)

12. Споры – По Цилю-Нильсену. Спора-красная, тело-синее

• Протопласты – полностью нет КС, не могут размножаться. Из грам+

• Сферропласты – частично лишены, из грам-

• L-формы – без кс, но способные размножаться: стабильные (генетически не имеют кс) и нестабильные (способны к реверсии)