1. Структура бактериальной клетки:

Все бактерии – это одноклеточные организмы. Имеют обязательные и необязательные структурные компоненты.

Обязательные: оболочка, цитоплазма и нуклеоид, рибосомы.

Необязательные: капсулы, жгутики, фибриллы, пили, споры, включения, плазмиды.

Оболочка бактерий состоит из 3 слоев:1) слизистого, поверхностного, капсулы – микро и макро, 2) собственно клеточной стенки и 3) ЦПМ – цитоплазматической мембраны.

1. Макрокапсула образуется у патогенных микроорганизмов при попадании в макроорганизм. Этот слой защищает клетку от антител, фагоцитов. Толстая капсула, сохраняющаяся в организме и в окружающей среде, бывает реже (у клебсиелл). Это родовой признак, признак вирулентности.

В капсулу входят полимеризованные “К”-антигены полисахариды, полипептиды, пептиды. Эти вещества обеспечивают антигенные свойства и серологическую индивидуальность (специфичность). Выявляют капсулу в электронном микроскопе и в световом при окраске по Бурри-Гинсу «готовый мазок из исследуемой культуры с тушью-по Бурри», а затем после высушивания и фиксации окрашивают карболовым фуксином : тушь создает фон, капсула бесцветная, клетка красная.

2. Клеточная стенка. Ее роль:

1. Придает форму микробной клетке.

2. Является осмотическим барьером.

3. Имеет своеобразное строение в виде “сита”, через поры которой в клетку проникают питательные вещества., а из клетки выделяются продукты метаболизма, токсины, ферменты.

4. Защищает клетку от неблагоприятных воздействий (температура, химические вещества).

5. В ней локализуются основные антигенные детерминанты, для взаимодействия со специфическими антителами и бактериофагами.

6. В клеточной стенке находятся ферменты, обеспечивающие рост клеточной стенки, а при гибели клетки – ее аутолиз.

7. Имеет сложный химический состав, который позволяет дифференцировать клетки на Гр+ и Гр- и т.д.

Сущность окраски по Граму. У Грам+ бактерий клеточная стенка толстая, имеет ригидный муреиновый слой (толстый слой пептидогликана и тейхоевые кислоты). Генцианввиолет свободно проникает в микробную клетку, образуя прочный комплекс с пептидоканом, и при действии спирта клетка не обесцвечивается. Грам- бактерии, имеющие тонкий муреиновый слой, обесцвечиваются спиртом и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином).

Под действиеем лизоцима, антибиотиков – растворяется клеточная стенка. Если полностью – образуется протопласт – L-формы бактерий. Они бывают нестабильные (восстанавливаются в исходную) и стабильные (не восстанавливаются).

Основная обязательная структура цитоплазмы.

Ядерный аппарат – нуклеоид

Это циркулярно-замкнутая двойная нить ДНК, располагается в цитоплазме в форме клубка.

У нуклеоида:

1. нет ядерной оболочки, нет ядрышек

2. нет белков, гистонов и протаминов

3. не делится митозом, т.к. нет митотического аппарата

Роль нуклеоида:

1. нуклеоид является хранителем генетической информации, она закодирована в ДНК

2. принимает участие в делении и спорообразовании.

Зерна волютина-метахраматические зерна. Их наличие-важный диагностический признак для некоторых бактерий. Обнаруживаются при сложной окраске по Нейссеру (уксуснокислая синька Нейссера-окрашивает избирательно щелочные зерна, щелочной визувин-окрашивает кислую цитоплазму в светло-коричневый цвет). При окраске просты методом (щелочной синькой) зерна окрашиваются более интенсивно, чем цитоплазма.

Жгутики бактерий – орган передвижения бактерий. Это тончайшие нити, одетые чехлом. Берут начало в цитоплазме. Связаны с телом клетки при помощи дисков. Наружный находится в клеточной стенке, внутренний в ЦПМ. В состав жгутиков входит белок флагеллин, он относится к числу сократительных белков. По наличию жгутиков и их расположению микробы разделяются на: монотрихи – имеющие 1 жгутик, лофотрихи – пучок жгутиков с одной стороны, амфитрихи – по одному жгутику или по пучку жгутиков по полюсам, перетрихи – жгутики по всей поверхности тела клетки, атрихии – без жгутиков.

Помимо жгутиков есть реснички “пилли, бахромки” – это органы прикрепления. Есть 2 вида пиллей – sex-pili через которые идет передача генетического материала из клетки донора в клетку реципиента в процессе конъюгации и пилли, общего типа обеспечивающие водно-солевой обмен.

Наличие жгутиков-видовой признак. Для изучения подвижности применяют: 1) прямые методы-электронная микроскопия, специальная окраска жгутиков серебрением. Что позволяет увеличить поперечный размер и увидеть в световом микроскопе. 2) косвенная: а) посев культуры уколом в полужидкий агар, б) приготовление весячей или раздавленной капли для микроскопии в световом или фазовоконтрастном микроскопе (наблюдаем движение микроба).

Споры и спорообразование – это приспособление к сохранению вида в неблагоприятных условиях. Микробы, образующие споры – бациллы (аэробы ); а если поперечник споры больше поперечника клетки – то это клостридии (веретенообразные), характерно для патогенных анаэробов. В спорах микробы находятся в состоянии анабиоза.

Спорообразование.

При попадании клетки в неблагоприятные условия активизируется группа генов, контролирующих спорообразование. Инактивируются гены, участвующие в контроле функции вегетации. В неактивное состояние переходят ферментные системы. Вода в спорах находится в связанном состоянии. Ядерная субстанция концентрируется и покрывается толстой, прочной, непроницаемой, термоустойчивой споровой оболочкой, имеющей несколько слоев. В ее составе много солей Са, дипиколиновой кислоты. Выявляют споры при помощи метода Ожешко. При этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативная часть в синий. При обычной микроскопии без специальной окраски споры видны в виде прозрачных шариков. Извитые формы бактерий: вибрионы, спириллы, спирохеты.

2.1.Морфология спирохет.

Спирохеты – (spira – завиток, chaite – волос) – тонкие, длинные, извитые бактерии спиралевидной формы. Они состоят из наружной мембраны (клеточная стенки), которая окружает протоплазматический цилиндр с цитоплазматической мембраной и аксиальной нитью-эндожгутики (аксистиль). Аксиальная нить-переплазматические жгутики, состоящие из 2-х пучков фибрилл, которые фиксируются по полюсам и направлены навстречу друг другу. Располагаются между ЦПМ и клеточной стенкой, закручиваясь вокруг протоплазматического цилиндра спирохеты, что придает ей винтообразную форму – это составляет первичные завитки.

. Число и расположение фибрилл варьирует у различных (1-100). Фибриллы участвуют в передвижении спирохет и придают клеткам вращательное, сгибательное, поступательное движение. При этом спирохеты образуют петли, завитки, изгибы, которые получили название вторичных завитков. Обычно спирохеты окрашивают по методу Романовского-Гимзы или серебрением, (грамотрицательны). В живом виде их исследуют с помощью фазово-контрастного или темнопольной микроскопии.

Патогенные спирохеты подразделяются на 3 рода:

I. Borrelia

II. Treponema

III. Leptospira

1. Спирохеты рода Borrelia имеют 3-8 крупных завитков, неравномерных, грубых. Содержат много нуклеопротеидов, хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. По Романовскому-Гимзе – сине-фиолетового цвета. Боррелии вызывают возвратный тиф и другие боррелиозы. У боррелий около 18 фибрилл.

2. Спирохеты рода Treponema имеют 8-12 мелких, равномерных, правильных завитков. Содержат мало нуклеопротеидов, много липидов, плохо окрашиваются анилиновыми красителями. По Романовскому-Гимзе бледно-розового цвета. Имеют 4 фибриллы. Патогенными представителями являются Treponema pallidum – возбудитель сифилиса и Treponema pertenus – возбудитель тропической болезни – фрамбезии. Имеются трепонемы сапрофиты – обитатели полости рта и ила водоемов.

3. Leptospira имеют завитки неглубокие, частые, в виде закрученной веревки. Концы этих нитевидных спирохет изогнуты на подобие крючков с утолщениями на концах. Образуются вторичные завитки, они приобретают вид букв S или С. почти не окрашиваются анилиновыми красителями. Изучают в темном поле, фазово-контрастном микроскопе. Имеют 1-2 фибриллы. Патогенный представитель – Leptospira interrogans. Патогенные лептоспиры попадают в организм с водой или пищей и приводят к развитию кровоизлияния и желтухи. Сапрофитные представители обитают в воде.

2.2. Риккетсии, микоплазмы.

Микоплазмы – самые мелкие среди прокариотов, способные к самостоятельному метаболизму и репродукции.

Среди микоплазм встречаются свободно живущие (сапрофиты), так и поражающие млекопитающих, птиц, насекомых. Микоплазмы полностью лишены клеточной стенки. Ввиду отсутствия клеточной стенки микоплазмы имеют разнообразную форму: кокковидную, кобовидную, нитевидную, звездчатую. Эти формы видны при фазово-контрастной микроскопии.

Микоплазмы грам-отрицательны, не имеют спор и капсул. Микоплазма окружена трехслойной липопротеиновой мембраной.

На специальных питательных средах микоплазмы образуют колонии, похожие на яичницу-глазунью.

Риккетсии – строгие внутриклеточные паразиты, не размножаются на искусственных питательных средах, их культивируют в курином эмбрионе, на лабораторных животных, в культурах клеток.

Грам- , полиморфны: кокковидные, палочковидные, бациллярные, нитевидные. Спор, жгутиков, капсул не имеют, вызывают риккетсиозы. Структура сходна с бактериями.

Хламидии – имеют очень малые размеры, сферическую или палочковидную форму, могут находиться в нескольких состояниях: 1. Элементарные тельца (инфекционная форма). Проникают в клетку хозяина и превращаются в 2)ретикулярные тельца, которые после нескольких циклов деления снова превращаются в ретикулярные тельца. В цитоплазме скопления ретикулярных телец образуют включения, окруженные оболочкой (хламидой).

3. Физиология микроорганизмов.

Особенности питания бактерий:

1) поступление питательных веществ внутрь через всю поверхность клетки

2) высокая скорость метаболизма.

3) быстрая адаптация к меняющимся условиям окружающей среды.

Типы питания.

Микробы нуждаются в углероде, азоте, кислороде, водороде, сере, фосфоре, калии и других элементах.

По источникам углерода для питания бактерии делятся на:

1. аутотрофы (aytos - сам, trophe - пища), которые используют для построения своих клеток диоксид углерода (CO₂) и другие неорганические соединения;

2. гетеротрофы (heteros - другой), которые питаются за счет готовых органических соединений.

Аутотрофами являются нитрифицирующие бактерии, которые находятся в почве, серобактерии, обитающие в воде, железобактерии, живущие в воде с закисным железом.

Гетеротрофы подразделяются на сапрофиты, которые используют органические остатки отмерших организмов и паразиты - нуждаются в белках живых тканей.

Выделяют облигатных и факультативных паразитов. Облигатные паразиты способны существовать только внутри клетки - это риккетсии, хламидии, вирусы. Факультативные паразиты могут менять тип питания и расти на питательных средах.

Выделяют 4 механизма проникновения веществ в клетку: 1) простая диффузия по градиенту концентрации; 2) облегченная диффузия по градиенту концентрации и с участием ферментов; 3) активный транспорт против градиента концентрации с затратой энергии и с участием пермеаз; 4) транслокации радикалов (перенос измененных молекул).

Рост и размножение бактерий.

Рост - увеличение размеров отдельной особи и упорядоченное воспроизведение всех химических компонентов и структур.

Размножение - процесс воспроизведения себе подобных особей, обеспечивающий продолжение существования вида.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Размножение бактерий происходит в несколько стадий. Начинается с репликации ДНК. Бактерии, растущие на плотной питательной среде, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S и R формы), различной консистенции и цвета, который зависит от пигмента бактерий.

Колонии - это скопление микроорганизмов одного вида, т.е. это чистая культура.

Основные принципы и методы культивирования бактерий.

Питательные среды, их классификация.

Питательные среды классифицируют по составу:

а) естественные - это натуральные продукты животного и растительного происхождения (молоко, яйца, сыворотка, кровь).

б) искусственные готовят по определенным рецептам из отваров животного происхождения с добавлением солей и пептона.

в) синтетические - содержат определенные химические соединения в точно указанных концентрациях (среда Сотона для возб. туберкулеза).

По консистенции бывают:

1) жидкие - МПБ, пептонная вода;

2) полужидкие

3) плотные - МПА - используют для выделения чистой культуры, получения отдельных колоний

По назначению среды подразделяют на:

1) универсальные - МПА, МПБ;

2) специальные - которые используют для выращивания определенных видов микробов (гонгококки на кровяном агаре);

3) элективные (селективные) - используют для выделения определенного вида микроба, размножение других видов на таких средах подавляется;

4) дифференциально-диагностические среды использует для изучения биохимических свойств микробов и дифференцировки одного вида микроба от другого по характеру их ферментативной активности. Например среда Эндо, в состав которой входит лактоза и индикатор. Если микробы расщепляют лактозу, образуются красные колонии, если не расщепляют - бесцветные.

Требования, предъявляемые к питательным средам:

1. Стерильность.

2. Наличие основных органических веществ.

3. Факторы роста (витамины, липиды).

4. Соответствующее рН (7,2-7,4).

5. Изотоничность (0,85% NaCl).

6. Прозрачность.

4. Ферменты бактерий.

Ферменты - активные биологические катализаторы, имеют: белковую природу, большой молекулярный вес, высоко специфичны, быстро действуют, термолабильн, способны сохранять свою активность и после гибели клеток.

Классификация ферментов:

1. экзо-ферменты, катализирующие процессы расщепления сложных веществ вне клетки;

2. эндо-ферменты - катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки.

По объекту действия они делятся:

а) ферменты белкового синтеза - связаны с рибосомами,

б) ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ, располагаются в ЦПМ и мезосомах,

в) ферменты первичного и вторичного распада белка,

г) ферменты, расщепляющие углеводы.

Известно более 2000 ферментов, которые объединены в 6 классов:

1. оксидоредуктазы - окислительно-восстановительные ферменты (к ним относят дегидрогеназы, оксидазы);

2) трансферазы - переносят отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим;

3) гидролазы – ускоряют реакции гидролиза – т.е. расщепление веществ на более простые с присоединением молекул воды (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы);

4) лиазы - разрывают связи между атомами углерода негидролитическим путем (карбоксилазы);

5) лигазы - ускоряют синтез сложных соединений из более простых (аспарагин-синтетаза);

6) изомеразы - превращающие органические соединения в их изомеры (фосфогексоизомераза).

Кроме этого есть: а) конститутивные ферменты - синтезируются клеткой постоянно (лиазы, оксидазы); б) индуктивно-адаптивные - синтезируются только в присутствии субстрата (пенициллиназа, щелочная фосфатаза).

У патогенных микробов есть еще и ферменты инвазии и агрессии, которые способствуют: проникновению, распространению и паразитированию микроорганизмов в макроорганизме (гиалуронидаза, коллагеназа, нейтрамикидаза, коагулаза, ДНК-аза).

Значение ферментов: 1) катализируют процессы дыхания, питания, размножения; 2) имеют значение в диагностике при определении вида возбудителя по биохимическим свойствам. С этой целью используют среды "пестрого ряда", на которых изучают способность ферментов микробов разлагать углеводы (среда Гисса), белки до конечных продуктов обмена (H₂S, индол, NH₃) Каждый вид микроба обладает определенным набором ферментов, что обусловлено генотипом. Наибольшая активность у непатогенных микробов. У патогенных микробов биохимическая активность ниже. Ферменты микробов используют в генетической инженерии.

Дыхание микроорганизмов - сопряженный окислительно-восстановительный процесс, при котором происходит перенос элементов от окисляемого вещества до восстанавливаемого, в результате образуется АТФ - универсальный аккумулятор химической энергии.

По типу дыхания все микроорганизмы разделяются на:

1) облигатные (строгие) аэробы,

2) облигатные анаэробы,

3) факультативные (необязательные) анаэробы,

4) микро-аэрофилы.

I. Строгие аэробы не могут жить и размножаться в отсутствии молекулярного кислорода, так как они его используют в ка­честве акцептора электронов.

II. Облигатные анаэробы способны жить и размножаться только в отсутствии свободного кислорода воздуха. Они могут образовывать АТФ в результате окисления углеводов, белков, липидов путем субстратного фосфорилирования до пирувата. Кислород для них является ядом, т. к. у строгих анаэробов нет фермента каталазы (расщепляет Н₂О₂ до Н₂О и О₂).

III. Факультативные анаэробы могут расти и размножаться как в присутствии кислорода, так и без него.

IV. Микроаэрофиллы - растут при сниженном парциальном давлении кислорода.

Методы культивирования строгих анаэробов:

1) Посев уколом в высокий столбик сахарного агара, сверху заливается слоем вазелинового масла.

2) Среда Киппа-Тароцци (МПБ, глюкоза, кусочки печени, мяса (как редуцирующие вещества), сверху слой масла.

3) Удаление воздуха из среды механическим путем. Используют анаэростаты, из которых воздух выкачивается насосом.

4) Замена воздуха другим, индифферентным газом, например водородом, который получают в аппарате Киппа.

5) Механическая защита от кислорода воздуха. Метод Виньяль-Вейона (в пипетки набирают среду с посевом и запаивают).

6) Химическое поглощение кислорода воздуха, например щелочным раствором пирогалола.

7) Биологический – совместное культивирование анаэробов и аэробов на одной чашке.