Условия действия ферментов

Любое изучение свойств ферментов, любое применение их в практической деятельности - в медицине и в народном хозяйстве - всегда связано с необходимостью знания, с какой скоростью протекает ферментативная реакция. Чтобы понять и правильно оценить результаты определения ферментативной активности, нужно совершенно отчётливо представить себе, от каких факторов зависит скорость реакции, какие условия оказывают на неё влияние. Таких условий много. Прежде всего, это соотношение концентрации самих реагирующих веществ: фермента и субстрата. Далее, это всевозможные особенности той среды, в которой протекает реакция: температура, кислотность, наличие солей или других примесей, способных как ускорять, так и замедлять ферментативный процесс, и так далее.

Действие ферментов зависит от ряда факторов, прежде всего от температуры и реакции среды (pH). Оптимальная температура, при которой активность ферментов наиболее высока, находится обычно в пределах 37 – 50˚С. При более низких температурах скорость ферментативных реакций снижается, а при температурах близких к 0˚С практически полностью прекращается. При повышении температуры, скорость также снижается и, наконец, полностью прекращается. Снижение интенсивности ферментов при повышении температуры, объясняется главным образом разрушением входящего в состав фермента белка. Поскольку белки в сухом состоянии денатурируются значительно медленнее, чем оводненные (в виде белкового геля или раствора), инактивирование ферментов в сухом состоянии происходит гораздо медленнее, чем в присутствии влаги. Поэтому сухие споры бактерий или сухие семена могут выдержать нагревание до гораздо более высоких температур, чем семена и споры более увлажненные.

Для большинства известных в настоящее время ферментов определён оптимум РН, при котором они обладают максимальной активностью. Эта величина - важный критерий, служащий для характеристик фермента. Иногда это свойство ферментов используют для их препаративного разделения. Наличие оптимума РН можно объяснить тем, что ферменты представляют собой полиэлектролиты и их заряд зависит от значения РН. Иногда сопутствующие вещества могут изменить оптимум РН, например буферные растворы. В некоторых случаях в зависимости от субстратов ферменты с неярко выраженной специфичностью имеют несколько оптимумов.

Важным фактором, от которого зависит действие ферментов, как установил впервые Сёренсен является активная реакция среды – pH. Отдельные ферменты различаются по оптимальной для их действия величине pH. Так, например пепсин, содержащийся в желудочном соке, наиболее активен в сильнокислой среде (pH 1 – 2); трипсин – протеолитический фермент, выделяемый поджелудочной железой, имеет оптимум действия в слабощелочной среде (pH 8 – 9); папаин, фермент растительного происхождения, оптимально действует в слабокислой среде (pH 5 – 6).

Отсюда следует, что величина (РН оптимум) - весьма чувствительный признак для данного фермента. Она зависит от природы субстрата, состава буферного раствора и поэтому не является истинной константой. Нужно иметь в виду также свойства ферментов как белковых тел, способных к кислотно-щелочной денатурации. Кислотно-щелочная денатурация может привести к необратимым изменениям структуры фермента с утратой его каталитических свойств.

Задача № 9

К препарату митохондрий печени крыс добавили НАД⁺. Активность каких ферментов цикла Кребса при этом увеличится?

Для обоснования ответа:

1. Напишите схему реакций цикла Кребса.

2. Какую функцию выполняет НАД⁺?

3. С какими ферментами цикла Кребса он работает?

Ответ к задаче №9

Изоцитратдегидрогеназа, 2-оксоглутаратдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, так как они являются НАД+-зависимыми.

Отв1)

Цикл Кребса протекает в митохондриях. Он представляет собой очень сложную систему, различные компоненты которой ( фиг. Различные компоненты могут возвращаться назад в систему в результате реакции карбоксилирования или процессов деградации. Для растительных тканей неизвестно, чтобы концентрации промежуточных продуктов цикла Кребса поддерживались постоянными при какой-либо постоянной физиологической нагрузке.

Отв2)

 Цикл трикарбоновых кислот впервые был открыт английским биохимиком Г. Кребсом. Он первым постулировал значение данного цикла для полного сгорания пирувата, главным источником которого является гликолитическое превращение углеводов. В дальнейшем было показано, что цикл трикарбо-новых кислот является тем центром, в котором сходятся практически все метаболические пути. Таким образом, цикл Кребса – общий конечный путь окисления ацетильных групп (в виде ацетил-КоА), в которые превращается в процессе катаболизма большая часть органических молекул, играющих роль «клеточного топлива»: углеводов, жирных кислот и аминокислот. Образовавшийся в результате окислительного декарбоксилирования пирувата в митохондриях ацетил-КоА вступает в цикл Кребса. Данный цикл происходит в матриксе митохондрий и состоит из восьми последовательных реакций (рис. 3). Начинается цикл с присоединения ацетил-КоА к оксалоацетату и образования лимонной кислоты (цитрата). Затем лимонная кислота (шестиуглеродное соединение) путем ряда дегидрирований (отнятие водорода) и двух декарбоксилирований (отщепление СО2) теряет два углеродных атома и снова в цикле Кребса превращается в оксалоацетат (четырехуглеродное соединение), т.е. в результате полного оборота цикла одна молекула ацетил-КоА сгорает до СО2 и Н2О, а молекула окса-лоацетата регенерируется. Рассмотрим все восемь последовательных реакций (этапов) цикла Кребса.

Задача № 10

В эксперименте к изолированным митохондриям добавили малат. Чему равен коэффициент Р/О для малата?

Для обоснования ответа:

1. Вспомните, что такое коэффициент Р/О?

2. Напишите реакцию окисления малата и укажите фермент.

Ответ к задаче №10

Коэффициент фосфорилирования ( Р/О) для малата равен 3, так как малатдегидрогеназа является НАД-зависимым ферментом.

Отв1)

Отношение количества связанной Н3Р04к количеству поглощенного кислорода (О) называют коэффициентом фосфорили-рования и обозначают Р/О; следовательно, коэффициент Р/О < 3. ФАД-зависи-мые дегидрогеназы мембраны митохондрий не являются протонными насосами: в этом случае в цепи переноса электронов действуют только два пункта перекачки протонов — комплексы III и IV, и коэффициент Р/О не может быть больше двух. Эти величины отражают теоретический максимум синтеза АТФ. Фактически часть энергии электрохимического потенциала используется не для синтеза АТФ, а для переноса веществ через митохондриальную мембрану при участии трансло-каз по механизмам симпорта и антипорта. Человек за сутки потребляет из воздуха около 600 л (~ 27 моль) кислорода. Подавляющая часть кислорода (примерно 90 %) восстанавливается до воды при участии дыхательной цепи. Если считать, что в митохондриях восстанавливается 25 моль 02 (т. е. 50 моль атомарного кислорода), а коэффициент Р/О = 2,5, то в митохондриях организма синтезируется 50 • 2,5 = 125 моль АТФ, т. е. около 60 кг АТФ в сутки. Конечно, такое же количество АТФ и распадается за сутки: эта величина характеризует не общую массу АТФ в организме, а скорость кругооборота АТФ-АДФ. Общее содержание АТФ в организме невелико, порядка 50 г. Каждая молекула АТФ расщепляется и вновь регенерируется 2500 раз в сутки, так что средняя продолжительность ее жизни меньше 1 мин. На каждое сокращение сердечной мышцы расходуется около 2 % имеющейся в ней АТФ. Вся АТФ израсходовалась бы за 1 мин, если бы не было ее регенерации. При образовании тромба в коронарной артерии поступление кислорода в клетки прекращается, соответственно прекращается и регенерация АТФ, и клетки погибают (инфаркт миокарда).

Отв2)

Этот процесс можно наблюдать в окислительной ферментативной системе цикла Кребса (цикл ди- и трикарбоновых кислот). 8 этап окислительно-восстановительная реакция, завершающая стадия. Малат подвергается дегидрирования (окислению) при участии НАД+ зависимой малатдегидрогеназы (МДГ).

На схеме окисления малата ферментные комплексы обозначены цифрами, укажите названия ферментов. Поясните схему. Малат (1)→ НАДН (2)→ QH₂ (3)→ Цитохром (4)→ H₂O Вот что я нашла по этому вопросу: Малатдегидрогеназа (1) — фермент, катализирующий последний этап цикла Кребса. НАДН дегидрогеназа (2) окисляет НАД-Н, отбирая у него два электрона и перенося их на растворимый в липидах убихинон, который внутри мембраны диффундирует к комплексу III. Вместе с этим, комплекс I перекачивает 4 протона из матрикса в межмембранное пространство митохондрии. Цитохромоксидаза – фермент, катализирующий конечный этап переноса электронов на кислород в процессе окислительного фосфорилирования.

Задача № 11

В эксперименте к изолированным митохондриям добавили сукцинат. Чему равен коэффициент Р/О для сукцината?

Для обоснования ответа:

1. Вспомните, что такое коэффициент Р/О?

2. Напишите реакцию окисления сукцината и укажите фермент.

Ответ к задаче №11

Коэффициент фосфорилирования ( Р/О) для сукцината равен 2, так как сукцинатдегидрогеназа является ФАД-зависимым ферментом.

Отв2)

COO^- COO^- COO^-

Цитрат цис-Аконитат Изоцитрат

Изоцитратдегидрогеназа использует в качестве акцептора электронов НАД⁺. Суммарная реакция, катализируемая изоцитратдегидрогеназой:

COO^- СОО ^- СОО ^-

| | |

H – C – H НАД⁺ CH₂ Н⁺ CH₂

| ↓ | ↓ |

H – C – COO^- ↔Н – C – COO^- ↔ НО– C – H

| ↓ | ↓ |

H – C – ОHНАДН+Н⁺ C = ОСО₂ C = О

| | |

COO^- COO^- COO^-

Изоцитрат Оксалосукцинат a-Кетоглутарат

 

НАД-зависимая дегидрогеназа содержится только в митохондриях и катализирует окисление изоцитрата в цикле Кребса. НАД-зависимая дегидрогеназа – аллостерический фермент, специфический активатор – АДФ. Катализируемая ею реакция сопровождается значительным уменьшением свободной энергии, поскольку отщепление СО₂принадлежит к числу сильно экзергонических (идущих с выделением энергии) реакций. На активность изоцитратдгидрогеназы влияет также АТФ и НАДН, которые сильно ингибируют фермент, главным счетом, за счет конкуренции с НАД⁺. Именно эта реакция является лимитирующей для всего цикла Кребса.

Окисление a-кетоглутарата протекает в 2 стадии. На первой стадии a-кетоглутарат подвергается окислительному декарбоксилированию, в результате чего образуется сукцинил-S–КоА и СО_2:

 

a-Кетоглутарат + НАД⁺ + КоА–SH ↔ Cукцинил-S–КоА + СО₂ + НАДН + Н⁺

DG¢ = – 8ккал

Эта реакция сходна с реакцией окисления пирувата до ацетил–КоА. Кофакторами фермента a-кетоглутаратдегидрогеназы являются тиаминпирофосфат, липоевая кислота, КоА, НАД⁺, ФАД.

На следующем этапе сукцинил–КоА утрачивает свою КоА-группу, но не путем обычного гидролиза, а в результате реакции с участием гуанозиндифосфата (ГДФ) и неорганического фосфата, при которой освобождающаяся энергия запасается в фосфатной связи ГТФ:

 

Сукцинил-S–КоА + Фн + ГДФ ® Сукцинат + ГТФ + КоА–SH, DG¢ = – 0,7ккал

Реакция катализируется ферментом сукцинилтиокиназой. Образовавшийся в результате этой реакции ГТФ отдает затем свою концевую фосфатную группу АДФ, вследствие чего образуется АТФ:

 

ГТФ + АДФ ↔ ГТФ +АТФ

Синтез АТФ, сопряженный с деацилированием сукцинил-S–КоА, часто называют фосфорилированием на уровне субстрата, чтобы отличить его от реакций фосфорилирования, протекающих при участии дыхательной цепи.

 

 

СОО^- COO^- COO^-

| | |

CH₂ НАД⁺ + КоА CH₂ Фн + ГДФ CH₂

| ↓ | ↓ |

H – C – H ↔ CH₂ ↔ CH₂

| ↓ | ↓ |

C = OНАДН + СО₂ C = OКоА + ГТФ COO^-

| |

COO^- S – KoA

 

a-Кетоглутарат Cукцинил-КоА Сукцинат

Задача № 12

В инфекционное и гастроэнтерологическое отделение БСМП поступили два больных с вирусным гепатитом и циррозом печени, соответственно. Наряду с другими жалобами оба больных отметили появления в последнее время больших синяков на теле при малейших ушибах. Анализ крови показал у обоих увеличение времени свертывания крови и снижение уровня протромбина в 2 раза.

1. О нарушении содержания какого витамина говорит врачу данная клиническая картина?

2. Какое лечение по этим симптомам должен назначить инфекционист, и какое – терапевт?

Ответ к задаче №12

Терапевт должен назначить викасол и терапию, свойственную циррозу печени. Инфекционист назначит лечение вирусного гепатита А.

Отв1)

Когда где-то на нашем теле красуется синяк, из лопнувших кровеносных сосудов под кожей в этом месте сочится кровь и наполняет ткани, окружающие зону ушиба. Это значит, что синяк пройдет только тогда, когда ре-абсорбируется скопившаяся кровь. Некоторые витамины помогают идти таким процессам быстрее, а также играют роль профилактических средств, защищая от слишком больших синяков в будущем.

Один из витаминов, который помогает справиться с синяками — витамин K. Этот витамин получил свое название от немецкого слова "koagulation", то есть коагуляция, свертывание. Витамин К укрепляет стенки кровеносных сосудов, делая образование синяков менее вероятным. Известно, что витамин K широко используется в медицине, в частности в пластической хирурги его применяют, чтобы ускорить заживление синяков после операции.

Нарушения свертываемости крови чаще всего проявляются в виде синяков, возникающих спонтанно или при незначительных травмах. Особенно, если они сочетаются с повторными носовыми кровотечениями или кровотечениями из других мест. Также повышается кровоточивость десен, появляются порезы, раны. К нарушениям свертываемости крови приводят ряд заболеваний крови и сосудов. Это может проявляться как в виде больших синяков и с трудом останавливающимися кровотечениями, так и мелкими множественными синяками в виде сыпи. 

Отв2)

Средства применяемые при нарушении свертываемости крови

Средства, понижающие или повышающие свертываемость крови, применяются в разных областях медицины. Особенно широкое применение получили антикоагулянты и другие средства, используемые для профилактики тромбообразования и развития тромбоэмболии, нередко возникающих после оперативных вмешательств, инфаркта миокарда и других заболеваний. В последнее время разработаны специальные схемы длительного применения противосвертывающих средств (антиагрегантов) для профилактики тромбозов у больных, перенесших инфаркт миокарда.

Противосвертывающие (антитромботические) средства делят на 3 группы: