2.Нанотехнологии и ранняя диагностика рака
Разработаны наносенсоры, с помощью которых можно обнаруживать биомаркеры рака в цельной крови. Это открытие может значительно упростить диагностику биомаркеров рака и других болезней.
Диагностика болезней с помощью биомаркеров - система раннего обнаружения заболевания, которая локализует недуг на той стадии, когда он легче всего поддается лечению. Биомаркеры - особые химические вещества, появление которых в организме сигнализирует о патогенном процессе, реакции на терапевтическое вмешательство или восстановлении нормальной деятельности.
Группа ученых из Йельского университета (США) разработала специальный сенсор - наноразмерные провода, которые регистрируют в крови и измеряют концентрации двух специфических биомаркеров - рака простаты и рака груди.
«Наносенсоры являются предметами активных исследований последние десять лет, однако их обнаружение было весьма сложным лабораторным процессом, требующим разделения крови. Мы впервые предложили методику их выявления в цельной крови - сложном растворе, содержащем белки, ионы и другие затрудняющие детектирование вещества», - объяснил один из руководителей исследования профессор Марк Рид.
Чтобы решить проблему регистрации биомаркеров в цельной крови, исследователи разработали миниатюрное устройство, которое работает как фильтр-ловушка таких веществ.
В данном случае удается обнаружить специфические антигены рака простаты и рака груди. Устройство записывает данные об антигенах на чип, тогда как основная масса крови просто проходит через него. Такой механизм позволяет детектировать очень небольшие концентрации вещества (порядка пикограмма - 10-12 г - на миллиметр) с точностью до 10%. Эта концентрация аналогична крупинке соли, растворенной в бассейне.
До появления этой работы экспериментальные методики исследования на биомаркеры ограничивались лишь обнаружением определенного вещества в качественно значимой концентрации.
Ни точную концентрацию биомаркера, ни присутствие микроколичеств такого вещества в организме определять было нельзя.
Предложенная методика не только позволяет значительно повысить разрешение метода - точность определения количества вещества - но и позволяет уменьшить влияние фактора интерпретации данных оператором-лаборантом.
Детектор-нанопровод способен провести точный анализ за несколько минут. Ученые предполагают, что в будущем таким приспособлением могут пользоваться обычные врачи в поликлиниках, а анализ на возможное развитие раковых заболеваний будет проводиться в экспресс-режиме, почти как измерение температуры.
Медики планируют приспособить новое устройство к обследованиям на течение широкого спектра заболеваний - от рака яичников до сердечно-сосудистых патологий.
3.Новые биомаркеры определят риск проблем с сердцем после менопаузы
Анализ кровяных белков группы женщин позволил выявить новые биомаркеры для определения риска ишемической болезни сердца и инсульта. Исследование показало, что бета 2-микроглобулин (B2M) повышен у женщин в период менопаузы с болезнями сердца. Он связан с риском инсульта, как инсулиноподобный фактор роста (IGFBP4).
Ученые из Центра исследования рака Фреда Хатчинсона проанализировали образцы крови 800 женщин с ишемической болезнью сердца и 800 пациенток, перенесших инсульт. Они сравнивали одинаковые образцы плазмы крови по трем группам. Ученые нашли два маркера B2M и IGFBP4, поясняющие воздействие гормональной терапии на развитие сердечно-сосудистых заболеваний.
Бета 2-микроглобулин и раньше связывали с риском развития ишемической болезни сердца и ее факторами, такими как возраст, артериальное давление и уровень С-реактивного белка. А также сообщали об обратной связи с уровнями липопротеинов высокой плотности (хорошим холестерином). То, что показатель B2M повышается в плазме за годы и месяцы до развития ИБС является открытием. Определение IGFBP4 в качестве маркера для риск инсульта после менопаузы — тоже относится к разряду инноваций.
Данные белки также позволяют изучить биологические процессы, влияющие на риск развития болезней
2. Преобразователи (трансдьюсеры) и мультисенсорные системы.
Трансдьюсер (англ. transducer преобразователь, датчик) преобразователь химического или биологического взаимодействия в электрический сигнал; Используемые в биосенсорах трансдьюсеры разнообразны. Наиболее часто применяются электрохимические преобразователи, в которых трансдьюсером является электрод, помещенный в исследуемый раствор. Оптические биосенсоры используют явления полного внутреннего отражения, поверхностного плазмонного резонанса, люминесценции. Гравиметрические сенсоры используют изменение массы при связывании аналита и обычно основаны на акустических волнах или пьезокварцевых микровесах.
3. Примеры реальных медицинских наномашин и бионанороботов.
Типичный медицинский наноробот, по видимому будет иметь микронные размеры, которые дают возможность двигаться по капиллярам, и состоять (на базе нынешних
взглядов) из высокопрочных и химически инертных материалов на основе углерода и его производных. В качестве основных источников энергии предполагается использовать локальные запасы глюкозы и аминокислот в теле человека. Лечение будет заключаться во введении нанороботов в человеческое тело для анализа ситуации и принятия решения о выборе метода лечения. Для коммуникации нанороботов в жидких средах могут быть использованы акустические сигналы, световые (электромагнитные) излучения, химические процессы. Химические реакции могут быть полезными для ближней ориентации и коммуникации нанороботов. Акустические сигналы являются более предпочтительными на дальних расстояниях, а оптическая связь, хотя и является более быстродействующей, потребляет значительное количество энергии.
Существует классификация медицинских роботов в зависимости от выполняемых программ на микрофагоциты, респироциты, клоттоциты, васкулоиды и другие.
Микрофагоциты являются искусственными иммунными клетками, предназначенными для очищения крови от вредных микроорганизмов, обеспечения свертывания крови, транспорта кислорода и углекислого газа и расширения возможностей иммунной системы. Микрофагоциты будут находить в организме человека чужеродные элементы и перерабатывать их в нейтральные соединения.
Респироциты аналоги эритроцитов (красных кровяных телец, доставляющих кислород к клеткам), которые должны иметь большую функциональность, чем природные эритроциты.
Клоттоциты - аналоги тромбоцитов (клеток, участвующих в свертывании крови). Эти машины позволят быстро прекращать кровотечения. Их функция заключается в
оперативной доставке к месту кровотечения связывающей сети, которая должна задерживать кровяные клетки, останавливая ток крови. Время и место выброса сети
задается внешними сигналами или определяется по парциальному давлению газов.
Васкулоид - механический протез, созданный на основе микрофагоцитов, респироцитов и клоттоцитов, и входящий в состав проекта по созданию робототехнической крови ("Roboblood", разработанный К. Фениксом и Р. Фрайтасом). В этом проекте описан комплекс медицинских нанороботов, способных жить и функционировать в теле
человека, выполняя все функции естественной кровеносной системы.
Зад. Количественные микрочиповые аналитические методы в экологии.
Билет 6
1. Классификация аналитических методов анализа в экологии и медицине.
Все аналитические методы основаны на получении и измерении аналитического сигнала – проявления химических или физических свойств вещества, которые можно использовать для установления качественного состава измеряемых объектов качественный анализ) или для количественной оценки содержащихся в нем компонентов (количественный анализ).
Цель качественного анализа – обнаружение элементов анализируемого объекта в виде атомов, молекул, ионов или идентификация индивидуального соединения. Для обнаружения и идентификации используют химические реакции с характерным внешним эффектом – выделение газа, появление осадка или окраска, а также физические свойства вещества – температура плавления или кипения, коэффициент преломления, характерный спектр. Свойства, используемые для обнаружения и идентификации, не зависят от количества вещества. Каждый метод характеризуется пределом обнаружения – минимальным количеством вещества, которое можно обнаружить или идентифицировать с допустимой погрешностью.
Цель количественного анализа – определение содержания компонентов в пробе по величине аналитического сигнала, зависящего от концентрации (интенсивность линии в спектре, количество осадка продукта реакции). Следует различать методы, основанные на измерении интенсивности сигнала в единственной измерительной позиции (например, при одной длине волны) и методы, в которых используется несколько позиций (спектр измерений). Методы первой группы – одномерные, методы второй группы – двумерные. Классические методы (гравиметрия и титрометрия) относятся к одномерным, а спектроскопические, хроматографические и электрохимические – к двумерным. По происхождению аналитического сигнала все методы подразделяются на химические, физико-химические и физические. В химических методах используют донорно-акцепторные реакции с переносом протона (кислотно-основные), электрона (окислительно-восстановительные), электронной пары (комплексообразование), процессы осаждения – растворения и экстракции. Аналитический сигнал (выделение газа, осадка, окраска) обычно фиксируют визуально. Физико-химические методы включают электрохимические, спектроскопические (оптические), люминесцентные, кинетические, термометрические методы. В этих методах измеряют аналитический сигнал, возникающий с участием внешних (валентных) электронов и функционально связанный с природой и концентрацией вещества. Сигнал возникает при взаимодействии вещества с различными видами энергии (электрическая, тепловая, электромагнитное излучение и др.). В физико-химических методах анализа как правило используют растворы веществ. Физические методы включают спектроскопические (не оптические), ядерно-физические и радиохимические методы. В этих методах возникновение аналитического сигнала связано с участием внутренних электронов или ядер атомов, агрегатное состояние и химическая форма веществ в большинстве случаев не имеет значения.
2. Основные аналитические характеристики сенсоров.
Каждый сенсор имеет рабочий диапазон температур, давлений и pH. Так как сенсор измеряет концентрацию аналита, то важными характеристиками являются точность, воспроизводимость, рабочий диапазон измерений. Чувствительность сенсора показывает отношение аналитического сигнала к концентрации аналита, вызвавшего этот сигнал. Более строго чувствительность определяется как максимальное значение производной величины отклика по концентрации. Важнейшей характеристикой сенсора является селективность, она отражает способность детектировать данный аналит в присутствии посторонних веществ.
Для количественного определения селективности используются два основных метода:
• построение калибровочных кривых для аналита и для посторонних примесей при одинаковых условиях эксперимента. При этом селективность выражается как отношение величины сигнала, вызываемого аналитом к величине сигнала, вызываемой примесью той же концентрации; • в ячейку, содержащую аналит, вводят примеси в концентрациях, которые ожидаются в реальных образцах, а селективность определяется как изменение сигнала в процентах. К временным характеристикам сенсоров относятся следующие: время отклика, время жизни и время регенерации. Время отклика – время необходимое для возникновения равновесия между анализируемым образцом и рецепторным слоем. Время жизни – это длительность воспроизводимой работы сенсора, которая ограничена деградацией рецепторного слоя. Время регенерации - это время, требуемое для восстановления работоспособности распознающего элемента. Наиболее часто распознающими элементами биосенсоров являются ферменты – высокоспецифичные катализаторы биохимических реакций. В состав фермента входит одна или несколько белковых молекул, иногда присутствует небелковая часть. Каталитическая активность ферментов значительно выше, чем у любых искусственных катализаторов, ферменты увеличивают скорость реакции в 103-107 раз. В некоторых случаях ферменты используются непосредственно в составе тканей организмов животных или растений (иммобилизованные на электроде ткани грибов). К биосенсорам на основе тканей идеологически близки устройства с использованием клеток в качестве распознающих элементов.
Обычно в состав сенсора входят: - распознающий элемент (рецепторный слой) - вещество, способное селективно взаимодействовать с аналитом; - трансдьюсер (англ. transducer преобразователь, датчик) преобразователь химического или биологического взаимодействия в электрический сигнал; - система сбора и обработки данных
3. Основные принципы создания бионаноробототизированных систем. Модульная организация определяет фундаментальные правила и иерархию построения био-наноробототизированных систем. Построение осуществляется через устойчивую интеграцию индивидуальных био- модулей или нано- компонентов, которые впоследствии и составят наноробот. Модульная организация позволяет био-нанороботам с определенными свойствами организовывать рои, что является желательным для некоторых применений. Модульная организация дает возможность создавать достаточно сложные многофункциональные био- нанороботы, например, состоящие из био- модулей A, B, C и D. В модуле А (SPHERE) могут быть расположены система энергоснабжения и информационный блок робота. Элемент DISC представляет некоторую пространственную область, определенную для Модуля D и для возможных его связей с другими внутренними ядрами. Окружающее ядро кольцо представляет пространственную область, определенную на внутреннем ядре для закрепления Модуля B и Модуля C. Модульная конструкция предполагает наличие универсального шаблона для био- нано-систем и элементов, которые возможно трансформировать в любую наносистему с требуемыми свойствами. Эта концепция повторяет природную концепцию развития эмбриональных стволовых клеток, которые являются своего рода примитивными клетками, но дают начало всем другим специализированным тканям человеческого тела. Чтобы точно управлять биомолекулами необходимы инструменты, которые могут взаимодействовать с этими объектами в нано масштабе в естественных окружающих средах. Существующие био- нанометоды манипуляции могут быть классифицированы как бесконтактные манипуляции, включая методы оптического и магнитного пинцета, и контактные манипуляции, например, взаимодействия через зонд АСМ. Зад. Биомедицинские нанотехнологии и экологическая безопасность.
Микро- и нанокапсулы.
Для доставки лекарственных средств в нужное место организма могут быть использованы миниатюрные (~1 мк) капсулы с нанопорами. Уже испытываются подобные микрокапсулы для доставки и физиологически регулируемого выделения инсулина при диабете 1-го типа. Использование пор с размером порядка 6 нм позволяет защитить содержимое капсулы от воздействия иммунной системы организма. Это дает возможность помещать в капсулы инсулин-продуцирующие клетки животного, которые иначе были бы отторгнуты организмом.
Микроскопические капсулы сравнительно простой конструкции могут взят на себя также дублирование и расширение естественных возможностей организма.
Примером такой концепции может послужить предложенный Р. Фрейтасом респироцит - искусственный носитель кислорода и двуокиси углерода, значительно превосходящий по своим возможностям как эритроциты крови, так и существующие кровезаменители (например, на основе эмульсий фтороуглеродов).
Нанотехнологические сенсоры и анализаторы
Использование микро- и нанотехнологий позволяет многократно повысить возможности по обнаружению и анализу сверхмалых количеств различных веществ. Одним из вариантов такого рода устройства является "лаборатория на чипе" (lab on a chip). Это пластинка, на поверхности которой упорядоченно размещены рецепторы к нужным веществам, например, антитела. Прикрепление молекулы вещества к рецептору выявляется электрическим путем или по флюоресценции. На одной пластинке могут быть размещены датчики для многих тысяч веществ.
Такое устройство, способное обнаруживать буквально отдельные молекулы может быть использовано при определении последовательности оснований ДНК или аминокислот (для целей идентификации, выявления генетических или онкологических заболеваний), обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний, токсических веществ.
Устройство размером в несколько миллиметров может быть помещено на поверхности кожи (для анализа веществ, выделяемых с потом) или внутри организма (в полость рта, желудочно-кишечный тракт, под кожу или в мышцу). При этом оно сможет сообщать о состоянии внутренней среды организма, сигнализировать о любых подозрительных изменениях.
В Институте молекулярной биологии им. Энгельгардта Российской академии наук разработана система, предназначенная для экспресс выявления штамма возбудителя; на одном чипе размещается около сотни флуоресцентных датчиков.
Интересную идею разрабатывают сразу несколько групп исследователей. Суть ее состоит в том, чтобы "пропустить" молекулу ДНК (или РНК) через нанопору в мембране. Размер поры должен быть таким, чтобы ДНК проходила в "распрямленном" виде, одно основание за другим. Измерение электрического градиента или квантового туннельного тока через пору позволило бы определить, какое основание проходит через нее сейчас. Основанный на таком принципе прибор позволил бы получить полную последовательность ДНК за один проход.
Медицинские применения сканирующих зондовых микроскопов
Сканирующие микроскопы представляют собой группу уникальных по своим возможностям приборов. Они позволяют достигать увеличения достаточного, чтобы рассмотреть отдельные молекулы и атомы. При этом возможно изучать объекты, не разрушая их и, даже, что особенно важно с точки зрения медико-биологических применений, в некоторых случаях изучать живые объекты. Сканирующие микроскопы некоторых типов позволяют также манипулировать отдельными молекулами и атомами.
Хороший обзор возможностей сканирующих микроскопов при изучении биологических объектов содержится в книге. Уникальные возможности сканирующих микроскопов определяют перспективы их применения в медико-биологических исследованиях. Это в первую очередь изучение молекулярной структуры клеточных мембран.
Билет 7
1. Критерии отбора пробы и характеристики аналитических методов. В общем случае могут быть сформулированы следующие критерии отбора биологической пробы. 1. Проба должна быть представительной по отношению к объекту анализа (т.е.количество пробы должно обеспечивать возможность обнаружения аналита); 2. Отбор пробы должен быть сделан в нужном месте и в нужное время (биологические пробы зависят от биоритмов пациента); 3. Проба не должна содержать загрязнений; 4. Проба должна быть устойчивой до выполнения анализа (иногда ее консервируют с целью предотвращения протекания химических реакций – окисления, восстановления, с участием бактерий и т.п.). Основная задача аналитических исследований — получение точной и адекватной информации о количественном, качественном и структурном составе пробы. Поэтому основными характеристиками аналитического метода являются: точность определения, разрешающая способность, чувствительность, помехоустойчивость, воспроизводимость, специфичность. Чувствительность определяет минимальную концентрацию исследуемого компонента, статистически достоверно отличающуюся от аналогичного показателя контрольной (холостой) пробы, которая может быть определена данным методом. Фактически, эта величина эквивалентна пределу обнаружения искомого компонента в пробе, т. е. минимальному количеству вещества, которое может быть обнаружено с достаточно высокой достоверностью. Воспроизводимость - соответствие результатов повторных измерений (определений) в одной и той же пробе. Величина, обратная воспроизводимости, характеризует разброс результатов (аналитическую вариацию), которая зависит от наличия случайных погрешностей. Специфичность характеризует возможность выявления искомого компонента в условиях мешающего влияния других компонентов среды, а также близких, но не идентичных по своей структуре ингредиентов. Необходимо учитывать, что исследуемая проба всегда представляет собой совокупность различных веществ, среди которых находится и аналит. Среди остальных компонентов пробы обязательно присутствуют составляющие, дающие неспецифические реакции, близкие к реакциям аналита. Такие реакции искажают результаты исследований и могут рассматриваться как помехи — примеси (фон). Выделяют два типа помех: аддитивные (представляют собой некоторый компонент пробы, количество которого не связано с количеством аналита) и мультипликативные (образующие прочное химическое соединение с полезной составляющей, количество которого пропорционально количеству аналита). Если для удаления аддитивных примесей иногда достаточно включить в технологическую процедуру, например, операцию фильтрования пробы, которая позволит отделить мешающие компоненты, то для выделениямультипликативных примесей необходимо применять более сложные методы трансформирования пробы (например, диализ, электрофорез и др.). 2. Люциферазные биосенсоры. Строение существующих люциферазных чи-пов.
Расширяются работы по созданию гибридных фермент-микробных датчиков, использующих комбинацию микробной и ферментной мембран в одном устройстве. Для амперо-метрического определения мочевины и креатинина применены гибридные биосенсоры с уреазой или креатинкиназой, иммобилизованными на пористой поливинилхлоридной мембране с аммиачным микробным БД.
Уреазный сенсор регистрирует мочевину в пределах 50—5 мг/мл, креатинин — 100— 5 мг/мл. Устойчивость его не менее 2 недели, а избирательность — достаточная для клинических анализов.
Сообщается о биосенсоре на L-тирозин на основе микробного СОг-датчика с прикрепленной L-тирозиндекарбоксилазой и мальтозном датчике, представляющем собой комбинацию глико-амилазы и клеток В. subtilis, а также о сенсорах с термофильными бактериями.
Разрабатывается микробный БД для измерения концентрации никотина, витаминов, липидов, азотистой кислоты, двуокиси азота, метана, количества бактерий и др.
Несомненными преимуществами микробных БД являются их более низкая стоимость и высокая устойчивость при хранении и проведении анализов в непрерывном режиме, хотя по селективности и времени ответа они уступают ферментным. Микробные БД перспективны для измерения характеристик окружающей среды и при контроле за биотехнологическими процессами.
Световые люциферазные биодатчики. Уникальными сенсорными системами, излучающими свет в результате обменных процессов, являются бактерии рода Photobacterium. Для аналитических целей используются иммобилизованные бактерии или выделенная люциферазно-редуктазная ферментная система. Построенные на их основе люциферазные БД обладают высокой чувствительностью и малой инерционностью.
Микробные люциферазные БД, содержащие иммобилизованные клетки P. fischeri, обеспечивают чувствительность измерения растворенного кислорода до 3.5 нМ, а перекиси водорода — 0,4 мкМ. С помощью лнофилизированных клеток P. fischeri определяют микотоксины пищевых продуктов (0.9—20,0 мкг/мл), а также следовые количества наркотиков и ядов. Некоторые штаммы P. fischeri являются чувствительными тест-системами различных поверхностно-активных веществ. Чувствительными сенсорами являются также темновые мутанты светящихся бактерий, способные восстанавливать свечение при добавлении напограммовых количеств различных мутагенов, канцерогенов, жирных кислот и липаз. Для контроля загрязнения окружающей среды токсическими веществами использованы генно-инженерные штаммы грамотрицательных бактерий, люциферазная система которых более чувствительна к биологически активным веществам
3. Управление нанороботами и молекулярные машины.
Чтобы точно управлять биомолекулами необходимы инструменты, которые могут взаимодействовать с этими объектами в нано масштабе в естественных окружающих средах. Существующие био- нанометоды манипуляции могут быть классифицированы как бесконтактные манипуляции, включая методы оптического и магнитного пинцета, и контактные манипуляции, например, взаимодействия через зонд АСМ.
Управление наноробототехническими системами может осуществляться: i) внутренними механизмами управления, ii) внешними механизмами управления или гибридом внутренних и внешних механизмов управления.
Внутренний механизм управления может быть активным и пассивным. Пассивный механизм - традиционный тип управления, который зависит от биохимической чувствительности и селективности связей биомолекул с другими элементами. Этот механизм эффективен, если известно как различные биомолекулы влияют на целевую
молекулу. Активный механизм управления является более сложным, так как предполагает изменение свойств элементов наноробота в зависимости от внешнего окружения (или от ситуации). В этом случае полезным является использование концепций молекулярных компьютеров.
Внешний механизм управления предполагает воздействие внешних полей на наноробот, приводящее к изменению динамики его движения в среде. Аналогичный подход используется, например, при управлении движением и ориентацией магнитных наночастиц в градиенте магнитного поля.
Зад. Методы медицинской и микробиологической нанодиагностики.
Методы измерения и контроля наноразмеров и контроля наноколичеств: интерферометрия, эллипсометрия, растровая электронная микроскопия, сканирующая туннельная и атомно-силовая микроскопия, вторичная ионная масс-спектрометрия, Оже-спектроскопия, электронная спектроскопия для химического анализа, рентгено-спектральный микроанализ, электронный и ядерный парамагнитный резонанс, ИК-Фурье спкетроскопия, хроматография, электрофорез.
Методы исследования структуры: рентгеноструктурный анализ, просвечивающая электронная микроскопия, электронография, дифракция быстрых и медленных электронов, малоугловая дифракция, обратное рассеяние Резерфорда. Атомно-зондовые методы анализа поверхности: контактные и бесконтактные методы, сверхлокальный контроль электрических и магнитных полей, измерение емкости и концентрации носителей заряда, адгезионных параметров.
Билет 8
1. Как можно управлять движением и разделением частиц в жидкости?
Движение жидкости, как и всякого тела, может быть равномерным и неравномерным по пути движения. Кроме того, движение жидкости может быть постоянным и переменным по времени (устойчивым или неустойчивым).
Равномерным движением называется такое движение, при котором скорости в подобных точках двух смежных сечений равны между собой, а траектории частиц прямолинейны и параллельны. Говорят, что поле скоростей не меняется течения. Ускорения частиц жидкости при этом равен нулю. В этом случае параметры потока не меняются течения. Неравномерное движение - такое движение, при котором параметры потока (например, скорости частиц жидкости) меняются течения.
Устойчивое движение - такое движение, при котором в любой точке пространства скорость течения не меняется ни по направлению, ни по величине по времени. Очевидно, что постоянное движение может быть и равномерным и неравномерным.
Неустановившиеся движение - движение, меняется по времени. Сплошное и прерывистое движения. Если движение происходит без образования пустот внутри движущейся жидкости, то он называется сплошным, в противном случае - прерывистым. Течение воды в реках - сплошное движение, а на - прерывистое.
Разделение движения на равномерное и неравномерное зависит от того, изменяются или не изменяются характеристики движения при переходе от одного сечения к другому одной и той же частицы.
А разделение движения на постоянное движение и неустановившийся происходит в зависимости от того, изменяются или нет характеристики движения частиц жидкости, проходящих через одну и ту же точку пространства, в зависимости от времени.
2. Основные биолюминесцентные тесты для экологического мониторинга.
Бактериальная биолюминесценция обладает высокой чувствительностью к действию различных ингибиторов биологической активности: анестетиков, наркотиков, промышленных ядов, инсектицидов, пестицидов, отравляющих и лекарственных веществ.
Отсутствие специфичности делает перспективным применение светящихся бактерий в экологическом мониторинге, где по воздействию на живые бактерии определяется токсичность суммы вредных веществ. Простота измерения люминесценции, экспрессность метода (время анализа 1-3 мин), высокая чувствительность (для различных классов соединений от 10-3 до 10-12М), возможность автоматизации измерений и статистической обработки данных обеспечивает светящимся бактериям несомненное преимущество по сравнению с другими биологическими тестами.
Имеющиеся интегральные биотесты с использованием живых организмов (парамеций, водорослей, дафний, рыб и т.д.) имеют ряд недостатков (трудоемкость, плохая воспроизводимость результатов, длительность анализа, трудности количественной оценки).
Биотесты на светящихся бактериях дают количественную меру токсичности и часто превосходят известные биотесты по быстродействию, точности, чувствительности и простоте, позволяют контролировать одновременно значительное число токсикантов.
Природные морские и наземные светящиеся бактерии, а также трансгенные штаммы микроорганизмов с клонированными в них lux-генами используются при изготовлении биолюминесцентных биотестов для оценки загрязнения природных водных источников, промышленных стоков и почв.
В основе этих методов лежит изменение интенсивности люминесценции биопрепаратов после воздействия того или иного анализируемого вещества. Концентрацию анализируемого вещества определяют, измеряя параметры излучения.
Исходя из современных требований, предъявляемых к оценке токсичности веществ биолюминесцентным способом, можно определить общепризнанные в токсикологии параметры. Такими параметрами являются: эффективная концентрация (ЭК50) - концентрация вещества, которая подавляет функцию люминесценции на 50%, и пороговая концентрация (ЛК0) или уровень биологически безопасного разведения (УББР) - концентрация (разведение) исследуемого вещества, при достижении которой уровень свечения исследуемых растворов равен интенсивности свечения в контрольных кюветах.
Светящиеся бактерии из коллекции культур ИБСО были успешно использованы для создания тест-систем на различные фенолы и их производные, сульфопроизводные янтарной кислоты и гексахлоранциклогексана (ГХЦГ).
Параллельно с использованием в биолюминесцентном анализе люминесцентных бактерий ведется разработка новых направлений биотестирования.
Одним из них является использование в качестве тест-объекта люминесцентных рекомбинантных штаммов различных микроорганизмов (E.coli, Pseudomonas, Salmonella, etc.), что позволяет упростить процедуру измерений и использовать биолюминесцентные биотесты для определения генотоксичности в медицине, экологическом мониторинге, биотехнологии, для оценки качества продукции пищевой промышленности и т.д.
Создаются и используются рекомбинантные биолюминесцентные штаммы для определения различных антибиотиков, тяжелых металлов. Использование рекомбинантных штаммов Е.соli с клонированным геном люциферазы оказалось эффективным при разработке биопрепарата для тестирования с помощью методов биолюминесцентного анализа пресных вод. Получены репортерные штаммы, обладающие высокой специфичностью к определенному токсическому агенту. Имеется ряд сообщений о создании биолюминесцентных репортеров для определения тяжелых металлов и фенолов в водных и почвенных образцах. Гены lux-оперонов, клонированные в несветящихся микроорганизмах, хорошо зарекомендовали себя в качестве модельных систем для изучения последствий случайной или целенаправленной интродукции трансгенных микроорганизмов в окружающую среду. Результаты мониторинга ТМ по биолюминесцентному сигналу подтверждаются более сложными методами молекулярной биологии. Другим направлением является исследование возможности использования клонированных lux-оперонов или их фрагментов для прогнозирования стабильности экспрессии чужеродных генов в различных условиях существования организма-хозяина. Такие маркерные системы созданы для большого количества микроорганизмов, а также для высших организмов и растений.
Биолюминесцентные биотесты Microtox, ToxAlert, LUMIStox на основе светящихся бактерий производятся несколькими зарубежными фирмами. Наибольшее применение за рубежом нашел биотест Microtox, который первым был разработан и широко используется в лабораторных и полевых исследованиях для контроля качества промышленных и природных вод, определения степени токсичности вновь создаваемых химических соединений и фармацевтических препаратов.
В России биолюминесцентные биотесты «Микробиосенсор В17-677F» (на основе светящихся лиофилизированных бактерий P.phosphoreum, 1983г.) и «Микробиосенсор ЕСК» (на основе генетически модифицированного штамма E.coli Z905, несущего плазмиду PHL1 с lux-геном из P.leiognathi).
Они используются в лабораторных и полевых исследованиях для контроля качества промышленных и природных вод определения степени токсичности химических соединений и фармацевтических препаратов. Биотесты “Микробиосенсор” являются стандартными тест-объектами для измерения интегральной токсичности исследуемых водных образцов, исключают необходимость культивирования и поддержания бактериальных культур с маркерным lux-геном. Кроме красноярских биолюминесцентных биотестов в России имеются разработанный в МГУ «Эколюм» (на основе светящихся лиофилизированных бактерий V.fischeri и генетически модифицированного штамма E.coli, 2003г) и в ИЭГМ УрО РАН микробиолюминесцентный индикатор токсичности (МИТ), (на основе генетически модифицированного штамма E.coli, Пшеничнов и др., 2005г.). По простоте и числу анализируемых веществ биолюминесцентные тесты сходны со спектрофотометрическими, но по чувствительности превосходят их на два-три порядка и отличаются простотой и экспрессностью.
В качестве тест-объектов вместо светящихся бактерий можно использовать также реакции, катализируемые люциферазой, биферментной системой: НАДН:ФМН-оксидоредуктаза – люцифераза. Тесты на основе многозвенных цепей сопряжения ферментов с люциферазами позволили значительно расширить круг веществ, анализируемых биолюминесцентным методом и включить в него соединения, не принимающие непосредственного участия в биолюминесценции. Использование ферментативных реакций в качестве индикаторных систем реакции антиген - антитело привело к созданию различных вариантов гомогенных и гетерогенных иммуноферментных методов, в которых в качестве ферментов - маркеров наряду с пероксидазой хрена и щелочной фосфатазой используются люциферазы.
Иммунобиолюминесцентные методы решают проблему избирательного анализа для веществ, не участвующих прямо или опосредованно в процессе биолюминесценции - ксенобиотиков, ингибиторов биологической активности и токсикантов.
В иммуноферментном биолюминесцентном анализе апробированы люциферазы почти всех светящихся организмов, причем наибольшей популярностью пользуется биолюминесцентная система светляков. Биолюминесцентный анализ используется в гистохимии для получения трехмерной картины распределения метаболитов в срезах тканей мозга, в "аутолюмографии" для определения локализации ферментов на фотопленку в полиак¬риламидном геле при электрофорезе и изоэлектрофокусировании. В последнее время для контроля популяций насекомых в сельском хозяйстве используют в качестве приманок их феромоны. На основе ферментов люминесцентной реакции: люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы производятся комплекты реактивов для биолюминесцентного анализа (КРАБы).
Комплект реактивов для аналитической биолюминесценции (КРАБ) используется как многокомпонентный реагент, иммобилизованный в крахмальном геле, разработаны методы определения активности NAD-зависимых дегидрогеназ - лактатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, протеаз и антипротеаз в плазме и сыворотке крови, биопсийном материале, платиноидов, и т.д.
На основе КРАБа и гидрогеназы водородных бактерий разработаны методы определения активности гидрогеназы и концентрации растворенного водорода. Отличительной особенностью ферментативных биотестов по сравнению, с биотестами, выполненными на живых организмах, является возможность варьирования их чувствительностью, изменяя условия проведения анализа, а именно состав реакционной смеси (количество ферментов и субстратов, объем добавляемой токсической смеси) и последовательность добавления компонентов реакции (использование прямой или обратной ADH-реакции и т.д.).
В экологических исследованиях биолюминесцентные тесты in vivo и in vitro взаимодополняют друг друга. Совместное использование биотестов позволяет расширить круг анализируемых токсикантов. В люциферазных биотестах действие токсических веществ происходит непосредственно на люциферазу - ключевой фермент метаболизма светящихся бактерий. В случае светящихся бактерий прямое влияние токсикантов на люциферазу ограничено клеточной стенкой и мембраной бактерий, препятствующих свободному проникновению любых посторонних веществ в клетки, однако происходит влияние на другие важные процессы жизнедеятельности клетки, так или иначе связанные с биолюминесценцией, например, дыхание. Совместное использование биолюминесцентных биотестов in vivo и in vitro позволяет получать разностороннюю информацию о механизмах воздействия токсических веществ.
Использование нескольких биотестов одновременно гарантирует полное обследование водоемов и водозаборов на токсичность независимо от структуры и физико-химических свойств токсикантов, токсичных как для целого организма, так и для клеток и ферментов. При этом в присутствии токсических веществ свечение может как уменьшаться, так и увеличиваться. Показателем наличия в среде токсичности служит изменение интенсивности исследуемого образца в сравнении со свечением в контроле
3. Наноразмерные исполнительные механизмы и АТФсинтаза.
Важным элементом наноробота является механизм, позволяющий ему перемещаться в пространстве. В природе встречается множество отработанных в течение столетий нанотехнологических механизмов и конструкций, принципы действия которых успешно используются в технике. Например, в некоторых конструкциях применяется принцип «ресничного» движения, встречающийся в природе. За счет колебания упругих элементов - «ресничек» осуществляется перемещение предметов
или же движение объекта по поверхности.
Биологические системы имеют совершенные молекулярные машины, действующие по адаптивной программе, зачастую поражающей своей эффективностью, а порой - и сложностью. К таковым следует отнести и молекулярные двигатели. Большинство естественных молекулярных механизмов в природе создано на основе белков, которые служат для решения задач транспорта, катализа реакций и т.д., в то время как ДНК выполняет в основном роль информационного хранилища.
АТФ-синтаза фермент, осуществляющий реакцию синтеза АТФ из АДФ и фосфат- аниона за счёт энергии трансмембранного протонного градиента, преобразуя её, таким образом, в энергию химических связей, которая может быть использована клеткой в биохимических реакциях. В случае, если фермент проводит обратный процесс: формирует трансмембранный протонный градиент за счёт гидролиза АТФ его называют аденозинтрифосфатазой, или АТФ-азой. Было установлено, что при гидролизе АТФ одна из частей энзима совершает вращательное движение, что может быть использовано при создании молекулярного двигателя.
Зад. Применение нанотехнологий для надежной экологической безопасности.
Билет 9
1. Электрофоретическое разделение проб в лабочипах.
Электрофоретические методы, идеально поддающиеся автоматизации, применяются для разделения биологических молекул в однородном электрическом поле (ионы, белки, ДНК). В основе метода лежит явление миграции ионов, т.е. их движения в электрическом поле. Классический метод электрофореза (Тизелиус А., нобелевская премия 1948г.) реализован как процесс перемещения ионов вблизи границы контакта двух растворов – исследуемого и буферного. Следующая модификация метода – электрофорез на носителе (бумага или гель): здесь ионы перемещаются в неподвижном слое носителя, пропитанного раствором инертного электролита. Исследуемый раствор наносят узкой полосой вблизи одного из концов носителя. В процессе электрофореза различные ионы образуют отдельные зоны - зонный электрофорез. И, наконец, современным методом анализа широкого круга объектов является капиллярный электрофорез. Метод капиллярного электрофореза (КЭ) основан на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля.
В настоящее время микрофлюидные чипы для электрофоретического разделения (МФЧЭ) применяются: для анализа неорганических и органических веществ; иммунного анализа; для анализа биомолекул, в том числе ДНК, РНК, белков; анализа продуктов полимеразной цепной реакции; результатов секвенирования ДНК; обнаружения мутаций и т. п.
2. Точные формулировки границ применимости для количественного мониторинга.
3. Молекулярные механизмы: кинезин, миозин, жгутиковый молекулярный двигатель.
Представители семейства кинезинов играют важную роль во многих клеточных процессах. Молекула кинезина может двигаться вдоль полимерных нитей, используя в качестве "топлива" молекулы АТФ. К подобным двигателям относятся белки актомиозинового комплекса, входящего в состав сократительного аппарата мышц. Движение микроворсинок (жгутиков и ресничек бактерий и простейших) определяется взаимодействием другой пары моторных белков - динеина и тубулина. Смещение головок динеина относительно тубулиновых микротрубочек белков обеспечивает волнообразные движения микроворсинок. Среди большого числа моторных белков миозин скелетных мышц и кинезин из клеток мозга являются наиболее изученными молекулярными моторами. Несмотря на то, что функции миозина и кинезина в клетке различаются, они похожи по своему строению и механизмам действия.
Совместно с микротрубками цитоскелета молекула кинезина выполняет транспорт веществ внутри клетки и перемещение везикул.
Одноклеточные организмы, типа бактерий Escherichia coli имеют оригинальный способ передвижения в вязкой среде с помощью молекулярных двигателей в виде «жгутиков» приблизительно 45 нм в диаметре. Подвижность является критической для клеток, поскольку они часто должны перемещаться от области не благоприятной до более приемлемой для существования окружающей среды. «Жгутики» представляют собой винтовые нити, которые ввинчиваются из клетки в среду и выполняют функцию, аналогичную винту или штопору. Вращение двигателей «жгутиков» стимулируется потоком ионов через них, который является результатом изменения трансмембранного транспорта ионов (рис. 8.6). Когда «жгутики» начинают синхронно вращаться против часовой стрелки, они сплетаются в единый пучок, который образует своеобразный винт.
Зад. Технологическая маршрутная карта экологического мониторинга.
Билет 10
1. Каковы основные методы анализ биологических проб на чипах? По происхождению аналитического сигнала все методы подразделяются на химические, физико-химические и физические. В химических методах используют донорно-акцепторные реакции с переносом протона (кислотно-основные), электрона (окислительно-восстановительные), электронной пары (комплексообразование), процессы осаждения – растворения и экстракции. Аналитический сигнал (выделение газа, осадка, окраска) обычно фиксируют визуально. Физико-химические методы включают электрохимические, спектроскопические (оптические), люминесцентные, кинетические, термометрические методы. В этих методах измеряют аналитический сигнал, возникающий с участием внешних (валентных) электронов и функционально связанный с природой и концентрацией вещества. Сигнал возникает при взаимодействии вещества с различными видами энергии (электрическая, тепловая, электромагнитное излучение и др.). В физико-химических методах анализа как правило используют растворы веществ. Физические методы включают спектроскопические (не оптические), ядерно-физические и радиохимические методы. В этих методах возникновение аналитического сигнала связано с участием внутренних электронов или ядер атомов, агрегатное состояние и химическая форма веществ в большинстве случаев не имеет значения. Четких границ между химическими и физико-химическими, физическими и физико-химическими методами нет. Физико-химические и физические методы иногда называют инструментальными. К особым методам следует отнести гибридные методы, сочетающие два или более метода анализа, например, хромато-масс-спектрометрия – сочетание хроматографии и масс-спектрометрии. Особенности инструментальных методов – необходимость калибровки (градуировки) шкалы приборов с помощью эталонов, обязательное проведение холостой пробы и т.д.
2. Основные этапы перехода от биотестирования к количественной экологии.
3. Неорганические (химические) молекулярные двигатели.
Молекулярные двигатели - наноразмерные машины, способные осуществлять вращение при приложении к ним энергии. Традиционно термин "молекулярный двигатели" применяется, когда речь заходит об органических белковых соединениях. Однако, в настоящее время его применяют и для обозначения неорганических молекулярных двигателей и используют в качестве обобщающего понятия. Возможность создания молекулярных моторов впервые была озвучена Р. Фейнманом в 1959 году.
Зад. Национальные технологические платформы России в экологии и биомедицине.
Технологическая платформа «Медицина будущего» является формой реализации частно-государственного партнерства, способом мобилизации возможностей заинтересованных сторон (государства, бизнеса, научного сообщества) и инструментом формирования научно-технической и инновационной политики для достижения конечных целей в направлении инновационного развития и технологической модернизации российской экономики в области медицины, фармацевтики и сопутствующих областях экономики.
Организации-координаторы Технологической платформы: Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (СибГМУ) Цель Технологической платформы: создать сегмент медицины будущего, базирующийся на совокупности «прорывных» технологий, определяющих возможность появления новых рынков высокотехнологичной продукции и услуг, а также быстрого распространения передовых технологий в медицинской и фармацевтической отраслях. Задачи Технологической платформы:
сформировать контактную площадку, создать условия и формат для эффективного взаимодействия участников медицинского и фармацевтического секторов экономики, в том числе бизнеса, науки и государства.
сформировать единое видение развития медицины для создания долгосрочных научных, инновационных и производственных стратегических программ.
сконцентрировать интеллектуальные, финансовые и административные усилия на создании и коммерциализации конкурентоспособных на внутреннем и внешнем рынке медицинских продуктов и услуг.
оптимизировать государственное регулирование научных и инновационных процессов, стандартизовать технологические регламенты и процедуры, изменить таможенное регулирование в области биомедицины в целях ускорения выведения продуктов на рынок.
гармонизировать ТП «Медицина будущего» с ТП Евросоюза, сформировать совместное пространство с ТП стран СНГ.
модернизировать врачебную среду и образовательное пространство, создать условия для внедрения в практическое здравоохранение новых медицинских продуктов и услуг.
вывести научные знания в область новых прорывных технологий для медицины, обеспечивающих снижение смертности, заболеваемости, увеличение продолжи-тельности и качества жизни, рост численности населения России.
Основные направления:
биоинформационные технологии
биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных (в части жизнеобеспечения и защиты человека)
геномные и постгеномные технологии создания лекарственных средств
клеточные технологии
нанотехнологии и наноматериалы (в части технологий и материалов для медицины)
технологии биоинженерии
технологии создания биосовместимых материалов
технологии создания электронной компонентной базы (в части создания приборов и оборудования для диагностики и лечения)
Технологическая платформа «Технологии экологического развития» является уникальным и необходимым механизмом взаимодействия частного и государственного секторов для решения различных актуальных вопросов и проблем в области окружающей среды. Организации-координаторы Технологической платформы:
Всероссийская общественная организация «Русское географическое общество»
Цель Технологической платформы:
формирование механизма повышения эффективности и конкурентоспособности экономики Российской Федерации на основе координации усилий науки, государства, бизнеса и потребителей по внедрению экологически эффективных и энергосберегающих российских технологий, решению накопленных экологических проблем, а также обеспечению экологической безопасности.
Задачи Технологической платформы:
разработка и внедрение технологий, обеспечивающих наряду с повышением эффективности и ресурсосбережением, снижение негативного воздействия хозяйственной и иной деятельности на природную среду и на здоровье населения, а также оздоровление окружающей среды и улучшение качества жизни;
формирование технологической базы для ликвидации накопленного ранее экологического ущерба, обеспечения экологической безопасности крупных энергетических и инфраструктурных проектов;
ликвидация отставания развития отечественных технологий в данной области от мирового уровня, обеспечение их конкурентоспособности на глобальных и национальных рынках;
повышение инновационной активности предприятий, в том числе на основе создаваемых в рамках технологических платформ механизмов координации прикладных исследований на доконкурентной стадии, совместного использования высокотехнологичного научного и лабораторного оборудования, формирования устойчивого партнерства с ведущими исследовательскими и образовательными организациями;
сосредоточение государственного финансирования исследований и разработок с учетом уровня их востребованности со стороны бизнеса с целью достижения максимального эффекта от соответствующих государственных затрат и для повышения конкурентоспособности экономики и увеличения объема привлекаемого софинансирования высокотехнологичных проектов из внебюджетных источников;
устранение дублирования исследований, финансируемых из разных источников, создание условий для объединения различных источников финансирования совместных инновационных проектов;
значительное расширение возможностей для эффективной коммерциализации технологий, в том числе путем формирования возможностей для оценки спроса на инновационные продукты и для привлечения частных источников финансирования инвестиционных проектов инновационной направленности.
Основные направления:
Экологически чистые технологии производства
технологии, снижающие/исключающие использование и образование в производственных процессах опасных веществ, материалов;
технологии и системы водоочистки и газоочистки, включая разработку экологически безопасных химических продуктов для очистки воздуха, внедрения специальных материалов, катализаторов, специальных поглотителей для систем фильтрации воздуха;
технологии использования новых типов изоляционных материалов для защиты поверхностных и грунтовых вод от техногенных и антропогенных воздействий;
технологии регулирования выбросов и снижения углеродоемкости производств с использованием рыночных механизмов углеродного финансирования.
Технологии, обеспечивающие экологически безопасное обращение с отходами, включая ликвидацию накопленного ранее экологического ущерба
технологии утилизации и переработки различных видов твердых бытовых отходов, с получением из них вторичного сырья и готовой продукции;
экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и оборудование для переработки отходов производства с получением изделий и материалов для массового применения, а также ценных компонентов;
технологии утилизации и переработки отходов пищевой промышленности и агропромышленного комплекса с получением из них вторичного сырья и готовой продукции;
технологии и оборудование для переработки и уничтожения материалов и сырья, содержащих опасные и особо опасные загрязняющие вещества, включая отходы нефтеперерабатывающей отрасли, медицинские и особо токсичные отходы;
технологии обеспечения экологической безопасности полигонов и объектов сферы обращения с отходами производства и потребления, включая особо токсичные;
технологии рекультивации свалок, хвостохранилищ, полигонов отходов, территорий, морских и внутренних акваторий, в том числе загрязненных нефтью и нефтепродуктами, включая очистку территории Арктической зоны Российской Федерации от химического и радиоактивного видов загрязнений.
Технологии и системы мониторинга, оценки и прогнозирования состояния окружающей среды, чрезвычайных ситуаций природного и техногенного характера, негативных последствий изменения климата, включая инновационные средства инструментального контроля загрязнения
технологии и системы оценки состояния и динамики ресурсов водных и наземных экосистем, восстановления ресурсного потенциала территорий с высокой антропогенной нагрузкой;
технологии и системы экологического мониторинга и прогнозирования состояния природной среды в крупных промышленных городах и на особо охраняемых природных территориях;
технологии и системы экологического мониторинга (наблюдения) береговых зон, акваторий, подземных вод, а также прогнозирования состояния компонентов природной среды Арктической зоны Российской Федерации, на базе многоцелевой российской космической системы «Арктика»;
технологии инструментального контроля выбросов/сбросов загрязнений в атмосферу, водные объекты, почвы;
технологии получения, передачи и использования информации о состоянии окружающей среды, ее изменении с использованием различных средств получения необходимой информации: наземных, воздушных, космических;
технологии и системы раннего обнаружения и прогнозирования чрезвычайных ситуаций природного и техногенного характера;
технологии управления экологическими рисками при освоении морских нефтегазовых месторождений на акваториях, в том числе в покрытых льдом районах;
технологии создания и актуализации кадастров территорий и акваторий с наибольшим уровнем экологического риска;
технологии и системы предупреждения трансграничного негативного воздействия на окружающую среду;
технологии и системы мониторинга экологических последствий изменений климата, включая процессы в зонах вечной мерзлоты.
Технологии рационального природопользования, обеспечения экологической безопасности и новых экологических стандартов жизни человека
экологически безопасные ресурсосберегающие технологии, обеспечивающие соблюдение нормативов качества окружающей среды с учетом природных особенностей территорий и акваторий, в том числе особо охраняемых природных территорий, а также рациональное природопользование;
технологии мониторинга и прогнозирования негативного воздействия погодно-климатических изменений, токсических веществ техногенного и природного происхождения и их совокупности на состояние здоровья населения, включая создание современной системы оценки вредного влияния указанных факторов на демографические показатели.