1. Метод подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т.Е. С фазовоконтрастной приставкой.

Производится подсчет тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости раствора оксалата аммония. При подсчете используют фазовоконтрастную микроскопию.

Исследование можно проводить как в крови, полученной из пальца, так и в стабилизированной цитратом венозной крови. В последнем случае полученный при подсчете результат умножают на коэффициент 1,1 (учитывают разведение венозной крови раствором цитрата натрия - 9:1).

В предварительно высушенную чистую пробирку пипеткой отмеряют 1,98 мл 1% оксалата аммония и осторожно вносят в нее 0,02 мл крови. В течение 1-2 мин содержимое пробирки тщательно перемешивают без вспенивания. Заполняют две камеры Горяева и на 10-15 мин помещают их для оседания тромбоцитов во влажную камеру (чашку Петри со смоченной фильтровальной бумагой или марлей). В каждой камере подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах.

2. Метод подсчета тромбоцитов в мазках крови (по Фонио)

Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов. Применяют 6% раствор этилендиаминтриацетата натрия (ЭДТА).

Смешивают кровь с раствором ЭДТА в соотношении 1:4 (для этого взятый капилляром Панченкова реактив до метки «75» вносять в пробирку, затем добавляют кровь, взятую до метки «0»). Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 30-45 минут (обычно окраска тромбоцитов занимает в 1,5 - 2 раза больше времени, чем окраска мазка для подсчета формулы крови). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая тромбоциты в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолировано). Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения считают количество эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов. Далее, зная количество эритроцитов в 1 мкл крови, легко подсчитать количество тромбоцитов с помощью пропорции.

Т – 1000 эритроцитов

Х – Э*10⁶ /мкл

Х= Т*Э*10⁶ /1000,

где Х – искомое количество тромбоцитов в единице объема крови.

3. Определение количества тромбоцитов с помощью гематологического анализатора

В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови, или гематологических анализаторов. Эти аппараты точны, и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин). Подсчет тромбоцитов проводят согласно инструкции к аппарату. Бюджетные модели гематологических анализаторов определяют только количество тромбоцитов, а более совершенные приборы содержат полный анализ тромбоцитарного звена, и позволяют говорить о морфологии тромбоцитов. Развернутый анализ тромбоцитов на анализаторе позволяет определить такие показатели:

• РLТ - количество тромбоцитов. Норма от 150-400*10⁹/л; При выходе за эти пределы необходима микроскопия мазка.

• MPV - средний объем тромбоцитов. «Молодые» тромбоциты имеют больший объем. MPV увеличивается с возрастом. Норма: 8-10 фл

• PDW ширина распределения тромбоцитов по объему отражает степень анизоцитоза тромбоцитов. Норма = 14-16%.

• РСТ – тромбокрит, доля объема цельной крови, занимаемая тромбоцитами (аналогичен гематокриту). Норма = 0,15-0,40%.

Также гематологический анализатор строит график распределения тромбоцитов по размеру:

Рис. 2. Распределение тромбоцитов по объему.

Количество тромбоцитов в крови здорового человека колеблется в пределах 150-400 ×10⁹/л.

Снижение числа тромбоцитов (<150 ×10⁹/л) – тромбоцитопения – может наблюдаться при следующих патологических и физиологических состояниях:

• острый ДВС-синдром;

• острый лейкоз и миелодиспластические синдромы;

• гипо- и апластические анемии;

• нарушение образования в организме тромбоцитопоэтина;

• химиотерапия и лучевая терапия;

• тромботическая тромбоцитопеническая пурпура и гемолитико-уремический синдром;

• спленомегалия и гепатолиенальный синдром;

• гепарин-индуцированная тромбоцитопения;

• эклампсия и преэклампсия;

• экстракорпоральное кровообращение;

• гемодиализ у больных с хронической почечной недостаточностью, гемосорбция;

• интенсивная трансфузионная терапия;

• пароксизмальная ночная гемоглобинурия;

• иммунные формы патологии (СКВ и др. коллагенозы, АФС, иммунная тромбоцитопеническая пурпура);

Повышение числа тромбоцитов (>400 ×10⁹/л) – тромбоцтоз – наблюдается в следующих случаях:

• мегакариоцитарные и миелолейкозы,

• эритремия;

• вторичный, реактивный тромбоцитоз в случае спленэктомии (через 1-3 недели),

• внутриполостные кровоизлияния после оперативных вмешательств,

• спустя 7-10 дней от начала подострого токсико-инфекционного ДВС-синдрома,

• после перенесенного острого кровотечения,

• при злокачественных новообразованиях (предвестник опухоли легкого, поджелудочной железы)

• других причинах хронического ДВС-синдома.

Нормальное количество тромбоцитов может не обеспечивать полноценный гемостаз при нарушении функциональных свойств тромбоцитов - тромбоцитопатиях. Поэтому также исследуют функциональные свойства тромбоцитов способность к спонтанной и индуцированной агрегации различными индукторами (агонистами) агрегации: АДФ, коллагеном, ристоцетином и т. д. Для исследования функциональных свойств тромбоцитов используют плазму богатую тромбоцитами.