6.2. Распределительная хромотография.
В распределительной хроматографии разделение веществ осуществляет-ся вследствие различной и притом обратимой сорбции компонентов смеси двумя несмешивающимися жидкими фазами — подвижным и неподвижным растворителями.
Колонку наполняют носителем (силикагель, окись алюминия, кизельгур и др.)-веществом, индифферентным к хроматографируемым веществам и в отношении к применяемому растворителю. Носитель удерживает на своей поверхности жидкую фазу — неподвижный растворитель.
Пробу хроматографируемого раствора, содержащего несколько компонентов, вносят в колонку и после того, как раствор впитается, промывают колонку подвижным растворителем. При этом происходит перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами.
Для получения четкого разделения смеси необходимо, чтобы компонен-ты ее не взаимодействовали с носителем и чтобы коэффициенты распределе-ния их сильно различались между собой. Только соблюдение этих условий дает возможность получать отдельные зоны чистых веществ при промывании колонки подвижным растворителем.
Распределительная хроматография, выполняемая в колонках, по харак-теру происходящих процессов аналогична адсорбционной, с той разницей, что в данном случае сорбентом является неподвижный растворитель.
Изотерма распределения веществ между двумя несмешивающимися жидкими фазами, как правило, линейна.
Коэффициент распределения. Распределение веществ между двумя фазами принято определять отношением количества вещества в неподви-жном растворителе к количеству вещества в подвижном растворителе. Подобное отношение концентраций называется коэффициентом распределения данного вещества, характерным для рассматриваемой системы, т. е.:
где К - коэффициент распределения; С неподв - концентрация определяемого компонента в неподвижной фазе, С подв - концентрация того же вещества в подвижной фазе.
Коэффициент распределения зависит от различных факторов: природы вещества, природы растворителя, температуры и способа проведения эксперимента.
Наибольшая скорость движения наблюдается у того компонента, который имеет наименьший коэффициент распределения между растворителями. Скорость движения фронта зоны можно определить по уравнению:
где l — высота зоны, содержащей определяемый компонент;
V - объем хроматографируемого раствора,
V подв- объем подвижного растворителя, приходящийся на объем колонки;
V неподв - объем неподвижного растворителя, приходящийся на объем колонки;
А — поперечное сечение колонки;
К — коэффициент распределения.
6.3.Бумажная. Тонкослойная.
Бумажная хроматография |
|
Специфическим для этого вида жидкостной хроматографии является применение такого сорбента, как бумага из чистой целлюлозы, на волокнах которой и происходит разделение по адсорбционному механизму сложного вещества на индивидуальные компоненты.
Главное требование к качеству бумаги — однородность и изотропность структуры. Существует несколько разновидностей бумажной хроматографии. Абсорбционная бумажная хроматография характеризуется тем, что используемая при исследовании бумага какой-либо предварительной обработке не подвергается. Распределительная хроматография отличается тем, что бумага предварительно пропитывается жидкостью, например, водой.
Для разделения компонентов смеси на один из концов полоски бумаги марки «хроматографическая» помещается капля анализируемого вещества в условиях равновесной влажности. После испарения растворителя крайний срез бумаги с нанесенным веществом помещается в кювету, содержащую подвижную фазу. Растворитель перемещается по волокнам бумаги под действием капиллярных сил. При этом происходит разделение исследуемого вещества на отдельные зоны (пятна); компоненты, хуже сорбирующиеся на гидратированных волокнах целлюлозы, передвигаются быстрее.
По направлению движения растворителя относительно образца бумаги различают восходящую, нисходящую, горизонтальную хроматографию. В первом случае нижний срез бумаги с нанесенным образцом опускается в рас-творитель, который поднимается снизу вверх под действием капиллярных сил. Во втором — растворитель протекает через слой бумаги сверху вниз под действием как капиллярных, так и гравитационных сил. В третьем случае растворитель перемещается по листу бумаги, находящемуся в горизонталь-ном положении. К достоинствам бумажной хроматографии относится достаточно высокая чувствительность, относительная простота проведения эксперимента, возможность исследования микроколичеств объектов. Однако этот метод менее точен, чем тонкослойная хроматография, так как величина Rf зависит от качества используемой бумаги и не всегда может быть строго установлена для какого-либо конкретного компонента. Поэтому бумажная хроматография имеет значение для экспертной практики, прежде всего, как способ качественного анализа (диагностики) веществ.
Чаще всего, метод используется при исследовании продуктов биологического происхождения (например, определение метаболитов сильнодействующих фармацевтических препаратов), для установления времени нахождения данных препаратов в организме и т.д.
ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Тонкослойная хроматография - метод хроматографического разделения, в котором компоненты смеси жидкостей разделяются за счет различного
поглощения в тонком слое материала, выложенного на пластинку.
Тонкослойная хроматография представляет собой метод быстрого и точного разделения компонентов смеси. Используемый обычно поглоща-ющий материал - сорбент, смешивается с водой и закрепляющими компо-нентами в пасту, которой покрывается пластинка и затем высушивается.
Капля смеси жидкостей помещается у одного края пластинки, которая устанавливается вертикально в кювету с растворителем. Растворитель поднимается по пластинке благодаря капиллярности и переносит раство-ренные в нем компоненты, но с различными скоростями, поскольку они взаимодействуют с сорбентом по-разному (Рис.5)
Рисунок 5 - Фотография хроматографической камеры с пластиной в системе растворителя
Рисунок 6 - Камеры хроматографические стеклянные
Камеры предназначены для проведения процесса хроматографирова-ния пластин после нанесения на них проб анализируемых веществ и стандартных растворов. Камеры изготавливаются из химически стойкого стекла двух типоразмеров: под пластины 10 x 10 см и под пластины 15 x 15 см. Камеры имеют разделительный выступ на дне для фиксации пластин и экономии элюента. Камеры оснащены пришлифованной крышкой (Рис. 6).
Размеры камер:
под пластины 10 x 10 см - 150 x 120 x 80 мм;
под пластины 15 x 15 см - 190 x 195 x 65 мм.
Процедура приготовления пластин для тонкослойной хроматографии
достаточно проста и может быть реализована в лабораторных условиях.
В качестве сорбентов используют мелкозернистые силикагель, Аl2О3, целлюлоза, полиамид, иониты и др.
Суспензиями этих сорбентов покрывают пластинки из стекла, фольги или пластика; для закрепления слоя применяют крахмал, гипс или другие связующие.
В результате тонкослойного разделения из смеси веществ образуется
хроматограмма - последовательность полос (пятен), которые можно идентифицировать с помощью специального реактива или по расстоянию, на которое они продвинулись за определенное время (Рисунок 7).
Рисунок 7 - Общий принцип реализации тонкослойной хроматографии
Промышленностью выпускаются готовые пластинки с уже закреплен-
ным слоем сорбента. Элюентами служат обычно смеси органических растворителей, водных растворов кислот, солей, комплексообразующих и др. веществ. В зависимости от выбора хроматографические системы
в разделении веществ основную роль могут играть процессы адсорбции, экстракции, ионного обмена, комплексообразования.
На практике часто реализуются одновременно несколько механизмов разделения.
В элюционном варианте на слой сорбента наносят капли (объемом 1-5 мкл) анализируемого раствора и погружают край пластинки в элюент, который находится на дне герметично закрываемой стеклянной камеры.
Элюент продвигается по слою сорбента под действием капиллярных и гравитационных сил; анализируемая смесь перемещается в том же направлении. В результате многократного повторения актов сорбции и десорбции в соответствии с коэффициентом распределения в выбранной системе компоненты разделяются и располагаются на пластинке отдельными зонами. После завершения процесса пластинку вынимают из камеры, высушивают и обнаруживают разделенные зоны по собственной окраске или после опрыскивания их растворами реагентов, образующих окрашенные или флуоресцирующие пятна с компонентами разделяемой смеси в УФ свете (Рисунок 10).
Радиоактивные вещества обнаруживают авторадиографически (экспо-нированием на рентгеновскую пленку, наложенную на хроматографии, пластинку). Применяют также биологические и ферментативные методы детектирования.
Рисунок 10 - Фотография тонкослойной хроматограммы цветных веществ
На разделение в ТСХ (величину Rf ) влияет ряд факторов:
свойства элюента;
состав смеси элюентов, соотношение между ними;
природа, дисперсность и пористость сорбента;
температура;
влажность;
размеры зерен и толщина слоя сорбента;
размеры камеры.
Поэтому для получения воспроизводимых результатов необходимо
тщательно стандартизовать условия опыта.
Достоинства ТСХ: простота, экономичность, доступность оборудова-ния, экспрессность (продолжительность разделения 10-100 мин), высокие производительность и эффективность разделения, наглядность результатов разделения, простота обнаружения хроматографических зон.
ТСХ применяют для разделения и анализа как органических так и не-
органических веществ: практически всех неорганических катионов и анио-
нов, в т. ч. близких по свойствам ионов благородных металлов, а также по-
лимеров, лекарственных средств, пестицидов, аминокислот, липидов, алка-
лоидов и т. д. С помощью ТСХ удобно анализировать микрообъекты (малые количества веществ), оценивать чистоту препаратов, контролировать технологические процессы и состав сточных вод, изучать поведение различных ионных форм элементов, предварительно подбирать условия для колоночной хроматографии.