41. Иммунобиотехнологиялық әдістері, жалпы сипаттамасы, артықшылықтары мен кемшіліктері.
Иммунноферменттік әдіс (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Иммуноферменттік әдіс антиденелердің белгілі бір антигенге ұқсастығына негізделінеді, Иммунноферменттік әдісте біріктірілген иммунохимиялық анализдің ерекшелігі, ферменттің жоғары сезімталдығы. ELІSA әдісті пайдаланады: аурулардың диагностикасын жүргізгенде, сұйықтарда әр түрлі заттарды анықтағанда. Тікелей әдіс: Антиденелерді қатты ұстаушқа енгізеді, ферменті антигенмен байланыстырады. Артықшылығы:*әдістің кезеңдері шамалы,*әдісті автоматандыру мүмкін.Кемшілігі: күрделі әдіс, ферментті коньюгаттардыі синтездеу әдісі әмбебаптықсыздығы ферменттің активтігіне ұлгінің компонентері әсер ету мүмкін. Тікелей емес әдіс: Антигенді қатты ұстаушқа енгізеді, ферментпен иммуноглобулиндерге қарсы алынған антиденелерді байланыстырады.Иммуноглобулиндер антигенге қарсы бағытталған.Тәсілдің артықшылығы: ферменттің каталитикалық қасиеттеріне әсер ететін эффектерін жою мүмкіндігі бар.
Радиоиммунды анализ (РИА) биологиялық сұйықтарда физиологиялық активті заттардың саңдық мөлшерін анықтау әдістің бірі. РИА радионуклидпен таңбаланған және таңбаланбаған заттардың ерекше жүйелермен бәсеке байланысуына негізделінеді, таңбаланған заттардың байланысқан мөлшері радиоспектрометр көмегімен тіркеледі (регистрация).
РИА мен ИФА әдістердің негізгі айырмашылығы *антидене немесе антиген радионуклидбен ферменттің орына таңбаланады. Таңба ретінде 125I пайдаланады. РИА әдісті ұсынған ғалымдар Р. Йалоу и С. Берсон (Yalow and Berson) 1977 жылы Нобель сыйлығын алды. РИА артықшылығы: жоғары сезімталдығы, жоғары ерекшелігі, иммунологиялық (антиген-антидене) реакцияға негізделінеді, жоғары нақтылығы; анализдің қарайымдылығы (простота выполнения анализа ) жоғары жылдамдығы. РИА кемшілігі: радиотаңбаның өмір сүретін уақыты шектелінген, сондықтан реактивтерді үнемі өзгерту керек болады, радиоактивтігін тіркеу үшін қымбат ерекше құралдар қажет; анализдің саңы көп болғанда айналадағы орта радиоактивті заттармен ластану мүмкін, сондықтан сақтану керек.
Иммунотропты препараттарды алу биотехнологиясы
Иммунотропты заттар иммундық жүйенің қызметіне, иммундық жүйенің компонентерінің қызметіне әсер етеді, нәтижесінде ағзаның иммундық реакцияларының күші, сипаттамасы және бағыты өзгередіИммунотропты заттар – иммундық жүйенің клеткаларының активтігін басу немесе күшейту қабілетті заттар.Иммунотропты заттарды – иммундық жүйенің қызметі бұзылғанда гуморалды немесе клеткалық иммунитетті қалпына келтіру үшін қолданады.
Иммунотропты препараттарды:
Табиғи
Синтетикалық,
Рекомбинанты
Табиғи заттарды шығу тегіне байланысты бөледі
*өсімдік препараттар (препараты эхинацеи пурпурной, солодки голой, Uncaria
fomentosa и др.),
*жануарлар препараттар (например, тимические препараты, эрбисол,
Иммуноглобулиндер),
*бактериялық препараттар (имудон, ИРС-19),
*саңырауқулақ препараттары (суспензия зимозана, имуномакс, натрия нуклеинат).
Синтетикалық препараттар - полиоксидоний, галавит, левамизол т.б.
Рекомбинанты - генно-инженериялық технологиялармен алынған препараттар
Интерферондар және интерлейкиндер. Интерферонды алу биотехнологиясы:
Лейкоциттерден жалпы мРНҚ препаратын бөліп алады, оның негізінде кері транскрипцияны жүзеге асырады. Алынған кДНҚ препараттың құрамында интерферонның кДНҚ-ның мөлшері 0,1% жүық.
Гибридизация әдісін пайдаланып сұрыптау жүргізеді де, адамның гендік библиотекасынан, жиынтық кДНҚ-ның 90% жуық кетіріледі.
Клондардың жиынтығынан гибридизация әдісінің көмегімен кДНҚ-ның бір түрін табады да бөліп алады.
кДНҚ-лардың қоспасынан интерферон кДНҚ-сын бөліп алады,
интерферон гені енген плазмидасы бар бактериялардың клонын табады.
Интерферон кодтайтын генді вектордың ДНҚ-сына енгізеді,
бактериялардың реттегіш элементтерін қосады.
Алынған кДНҚ-да адам интерферон алғы затының толық
құрамы туралы мәлімет жазылған.
Жасушаларда интерферон белсенді емес, ізашары түрінде түзіледі, молекуласының N-соңғы жағында сигналдық пептид орналасады. Интерферон полипептид тізбегі түзелгеннен кейін сигналдық пептид ерекше ферменттің әсерінен бөлініп кетеді, интерферон белсенді түріне айналады.Бактерия жасушаларында интерферонның белсенді түрі түзілу үшін керек ферменттер болмайды. Бактерияның плазмидасына сигналды пептиді жоқ белсенді интерферон молекуласын кодтайтын генді бөлігін енгізу керек.
- Интерферонды кодтайтын геннің құрамында Sau 3А1 рестриктаза ыдырататын үш учаскесі бар. Бір учаскесі сигналдық бөлігінің қасында орналасады.
- Sau 3А1 рестриктаза көмегімен шектелген гидролизді қолданып жетілген интерферонды кодтайтын геннің бөлігі алынады.
Ферменттің әсерінен сигналдық бөлігімен бірге цистеинді кодтайтын триплет бөлініп кетеді, сондықтан бірінші цистеин қалдығы болмайды.
Цистеинді кодтайтын триплеті және сонымен байланысқан ақуыз синтезінің басталу нүктесін белгілейтін триплеті бар ДНҚ-ның кішкентай фрагменті химиялық синтезбен алынды.
Химиялық синтезбен алынған фрагменті геннің бөлігіне байланыстрады,
- жетілген интерферонды кодтайтын геннің толық полинуклеотидтік тізбегі алынады.
- Белсенді интерферонды кодтайтын геннің бөлігін плазмидаға
ДНҚ-ның промоторы қасына енгізеді, плазмиданы бактерия жасушаларға кіргізеді.
- Трансформацияға ұшыраған бактерия жасушаларда β-ИФ синтезі жүзеге асырылады.
- Жасушалардың экстрактілері вирустарға қарсы белсендігіне зертейді.
- Интерферонды бөліп алады, қасиеттерін зерттейді, қаннан алынған интерферонның қасиеттерімен салыстырады.
Генді-инженериялық әдіс пайдаланып алған бактериялардың интерферонды синтездейтін қабілеттілігі жоғары.
альфа-Интерферонды алу биотехнологиясы, жауапты сызба түрінде беріңіздер Интерферон - бір полипептидтік тізбектен құрылған глобулярлы ақуыздар. Альфа интерферон молекуласын 836 нуклеотидтен құрылған ген кодтайды. Бета интерферон молекуласын 865 нуклеотидтен құрылған ген кодтайды.
α-Интерферондар - қарапайым ақуыздар,
β-Интерферон – гликопротеид,
γ-интерферон – гликопротеид.
Лейкоциттік интерферон (α-интерферон) – ортасы гидрофобты глобулярлі ақуыз, молекуланың 65% β-қатпарларымен бөлінген α-спираль түрінде (αβα-құрылымдар).
Алғаш рет интерферонды Ұлтық медициналық зерттеу институтында (Лондон) Айзекс және Линденман 1957 ж. адам қаннан бөліп алды. Өндірісте интерферондардың көзі ретінде қанды пайдаланады. Қан құрамында интерферонның мөлшері 10-9 - 10-12 г. Адамның 1 л қанынан ИФ 1 мкг ғана алынады, ауруларға енгізетін 1 ғана дозасы. Қазіргі күнде α-интерферонды алу өндіріс технология жасуша себіндісіне негізделнеді. Лейкоцитер себінді жағдайда ұрпақтанбайды.
Лейкоциттерді лимфобластоид жасушаларына дейін өзгерткенде, олар
себінді жағдайда өседі.
α-Интерферонның өндірісі лимфобластоид жасушалардың себіндісін пайдаланып жүзеге асырылды (Жапония, 1980 ж.).
Лимфобластоидтердің себіндісін Сендай вирустың әсерімен стимулдейді,
жасушаларда интерферон синтезінің деңгейін жоғарылатады.
Интерферонды моноклоналды антиденелердің көмегімен, аффиндік хроматография әдісімен қоспадан бөлініп алады.
Гибридті интерферондарды алу. Екі a-интерферонның гендерін бір рестрикция эндонуклеаза әсерімен белгілі жерлерде кеседі.
- Геннің N- және С-соңғы бөліктерін бөліп алады.
- Бір геннің N-бөлігіне екінші геннің С-соңғы бөлігін қосады, екінші геннің N-бөлігіне бірінші геннің С-соңғы бөлігін қосады.
Гибридті гендерді бактерия немесе ашытқы жасушаларына енгізеді, экспрессиясын жүзеге асырады.
- Гендер гибридті интерферондардың синтезін кодтайды. алынған гибридті интерферондардың қасиеті алғашқы интерферондардан өзгеше.
Сонымен, жаңа медициналық препараттарды жасау мүмкіндігі жүзеге асырылды.. Адам интерферонның синтезін жүзеге асыратын микроорганизмдерді генді-инженериялық әдісті қолданып алды.
Әдістің киыншылығы:
интерферон мРНҚ-сын бөліп алу мүмкін емес.
Интерферон мРНҚ-сын алу
Лейкоциттерден жалпы мРНҚ препаратын бөліп алады, оның негізінде кері транскрипцияны жүзеге асырады. Алынған кДНҚ препараттың құрамында интерферонның кДНҚ-ның мөлшері 0,1% жүық.
Гибридизация әдісін пайдаланып сұрыптау жүргізеді де, адамның гендік библиотекасынан, жиынтық кДНҚ-ның 90% жуық кетіріледі.
Клондардың жиынтығынан гибридизация әдісінің көмегімен кДНҚ-ның бір түрін табады да бөліп алады.
кДНҚ-лардың қоспасынан интерферон кДНҚ-сын бөліп алады,
интерферон гені енген плазмидасы бар бактериялардың клонын табады.
Интерферон кодтайтын генді вектордың ДНҚ-сына енгізеді,
бактериялардың реттегіш элементтерін қосады.
Алынған кДНҚ-да адам интерферон алғы затының толық
құрамы туралы мәлімет жазылған.
Жасушаларда интерферон белсенді емес, ізашары түрінде түзіледі, молекуласының N-соңғы жағында сигналдық пептид орналасады. Интерферон полипептид тізбегі түзелгеннен кейін сигналдық пептид ерекше ферменттің әсерінен бөлініп кетеді, интерферон белсенді түріне айналады.Бактерия жасушаларында интерферонның белсенді түрі түзілу үшін керек ферменттер болмайды. Бактерияның плазмидасына сигналды пептиді жоқ белсенді интерферон молекуласын кодтайтын генді бөлігін енгізу керек.
- Интерферонды кодтайтын геннің құрамында Sau 3А1 рестриктаза ыдырататын үш учаскесі бар. Бір учаскесі сигналдық бөлігінің қасында орналасады.
- Sau 3А1 рестриктаза көмегімен шектелген гидролизді қолданып жетілген интерферонды кодтайтын геннің бөлігі алынады.
Ферменттің әсерінен сигналдық бөлігімен бірге цистеинді кодтайтын триплет бөлініп кетеді, сондықтан бірінші цистеин қалдығы болмайды.
Цистеинді кодтайтын триплеті және сонымен байланысқан ақуыз синтезінің басталу нүктесін белгілейтін триплеті бар ДНҚ-ның кішкентай фрагменті химиялық синтезбен алынды.
Химиялық синтезбен алынған фрагменті геннің бөлігіне байланыстрады,
- жетілген интерферонды кодтайтын геннің толық полинуклеотидтік тізбегі алынады.
- Белсенді интерферонды кодтайтын геннің бөлігін плазмидаға
ДНҚ-ның промоторы қасына енгізеді, плазмиданы бактерия жасушаларға кіргізеді.
- Трансформацияға ұшыраған бактерия жасушаларда β-ИФ синтезі жүзеге асырылады.
- Жасушалардың экстрактілері вирустарға қарсы белсендігіне зертейді.
- Интерферонды бөліп алады, қасиеттерін зерттейді, қаннан алынған интерферонның қасиеттерімен салыстырады.
Генді-инженериялық әдіс пайдаланып алған бактериялардың интерферонды синтездейтін қабілеттілігі жоғары.
1 л суспензияда 1011 бактерия жасушалары болғанда 5 мг интерферон түзілуі мүмкін. Қанның 1 л-ден интерферонның 1 мкг алынады. Генді-инженериялық әдістің шығымы 5000 есе жоғары. Генді-инженериялық технологияны пайдаланып α, β, γ-интерферондарды синтездейтін бактериялардың штамдары жасалынды.