25 Влияние рН на заряд белка

Амфотерность

Свойства белков следуют из их строения

К физико-химическим свойствам белков относят амфотерность, растворимость, способность к денатурации,коллоидные свойства.

Так как белки содержат кислые и основные аминокислоты, то в их составе всегда имеются свободные кислые (СОО–) и основные (NH3+) группы.

Заряд белка зависит от соотношения количества кислых и основных аминокислот. Поэтому, аналогично аминокислотам, белки заряжаются положительно при уменьшении рН, и отрицательно при его увеличении. Если рН раствора соответствует изоэлектрической точке белка, то заряд белка равен 0.

Если в пептиде или белке преобладают кислыеаминокислоты (глутамат и аспартат), то при нейтральных рН заряд белка отрицательныйи изоэлектрическая точка находится в кислой среде. Для большинства природных белков изоэлектрическая точка находится в диапазоне рН 4,8-5,4, что свидетельствует о преобладании в их составе глутаминовой и аспарагиновой аминокислот.

Если в белке преобладают основныеаминокислоты (лизин и аргинин) – при нейтральных рН зарядположительныйи обусловлен этими, положительно заряженными, аминокислотами.

Амфотерность имеет значение для выполнения белками некоторых функций. Например, буферные свойства белков, т.е. способность поддерживать неизменным рН крови, основаны на способности присоединять ионы Н+ при закислении среды или отдавать их при защелачивании.

С практической стороны наличие амфотерности позволяет разделять белки по заряду (электрофорез) или использовать изменение величины рН раствора для осаждениякакого-либо известного белка. Наличие как положительных, так и отрицательных зарядов в белке обуславливает их способность к высаливанию, что удобно для выделения белков в нативной конформации.

При смещении рН в растворе изменяется концентрация ионов Н+. При закислении среды (при снижении рН) ниже изоэлектрической точки ионы Н+ присоединяются к отрицательно заряженным группам глутаминовой и аспарагиновой кислот и нейтрализуют их. Заряд белка при этом становится положительным. При увеличении рН в растворе выше изоэлектрической точки концентрация ионов Н+ снижается и положительно заряженные группы белка (NH3+-группы лизина и аргинина) теряют протоны, их заряд исчезает. Суммарный заряд белка становится отрицательным.

Так как большинство белков несет много заряженных групп, то в целом они водорастворимы. Растворимость объясняется:

· наличием зарядаи взаимоотталкиванием заряженных молекул белка,

· наличием гидратной оболочки – чем больше полярных и/или заряженных аминокислот в белке, тем больше гидратная оболочка. Например, 100 г белка альбумина связывает 30-50 г воды.

26 Методы количественного определения белков

Для определения концентрации белков в биологических жидкостях и растворах используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.

Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:

· спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм.Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

· рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

· нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

· поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.

Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).

Выделение белков из тканей включает несколько этапов.

1. Гомогенизация (измельчение) ткани для разрушения клеточных и внутриклеточных мембран, препятствующих выделению белков. В процессе гомогенизации нередко добавляются детергенты.

2. Экстрагирование (растворение) белков проводят чаще всего слабыми солевыми растворами.

3. Отделение низкомолекулярных веществ (солей) методом диализа с использованием полупроницаемых мембран, методом гель - фильтрации.

4. Очистка белка от сопутствующих белков (фракционирование), основанная на различных физико-химических свойствах белков.

а) ультрацентрифугирование – разделение белков по молекулярной массе;

б) электрофорез – разделение белков по заряду молекулы и молекулярной массе;

в) фракционное высаливание – подбор концентрации соли для осаждения различных белков;

г) хроматографические методы разделения:

· распределительная хроматография – по различной растворимости белков;

· гель-фильтрация – по различной молекулярной массе белков

· ионообменная хроматография – по разнице зарядов белковых молекул

· аффинная хроматография – по химическим свойствам различных белков

5. Выделение белка в кристаллическом состоянии проводится путём лиофилизации (высушивания) при низкой температуре.

27 Пептидная теория Э.Фишера 

Немецкий химик Эмиль Фишер, уже прославившийся на весь мир исследованиями пуриновых соединений (алкалоидов группы кофеина) и расшифровкой структуры сахаров, создал пептидную теорию, во многом подтвердившуюся практически и получившую всеобщее признание еще при его жизни, за что он был удостоен второй в истории химии Нобелевской премии (первую получил Я.Г. Вант-Гофф).

Немаловажно, что Фишер построил план исследования, резко отличающийся от того, что предпринималось раньше, однако учитывающий все известные на тот момент факты. Прежде всего он принял, как наиболее вероятную гипотезу о том, что белки построены из аминокислот, соединенных амидной связью:

Такой тип связи Фишер назвал (по аналогии с пептонами) пептидной. Он предположил, что белки представляют собой полимеры аминокислот, соединенных пептидной связью. Идея о полимерном характере строения белков как известно высказывалась еще Данилевским и Хертом, но они считали, что "мономеры" представляют собой очень сложные образования - пептоны или "углеазотные комплексы".

Доказывая пептидный тип соединения аминокислотных остатков. Э. Фишер исходил из следующих наблюдений. Во-первых, и при гидролизе белков, и при их ферментативном разложении образовывались различные аминокислоты. Другие соединения было чрезвычайно трудно описать а еще труднее получить. Кроме того Фишеру было известно, что у белков не наблюдается преобладания ни кислотных, ни основных свойств, значит, рассуждал он, амино- и карбоксильные группы в составе аминокислот в белковых молекулах замыкаются и как бы маскируют друг друга (амфотерность белков, как сказали бы сейчас).

Решение проблемы строения белка Фишер разделил, сведя ее к следующим положениям: 1) Качественное и количественное определение продуктов полного гидролиза белков. 2) Установление строения этих конечных продуктов. 3) Синтез полимеров аминокислот с соединениями амидного (пептидного) типа. 4) Сравнение полученных таким образом соединений с природными белками.

Из этого плана видно, что Фишер применил впервые новый методологический подход - синтез модельных соединений, как способ доказательства по аналогии.

Биуретовая реакция, цветная реакция на биурет, которую осуществляют, прибавляя к щелочному раствору последнего разбавленный водный раствор соли Сu²⁺ (обычно CuSO₄). При этом раствор окрашивается в интенсивный фиолетовый цвет благодаря образованию комплексного соед. (формула I, М⁺ - катион щелочного металла). В реакцию, подобную биуретовой, вступают многие вещества, содержащие в молекуле не менее двух амидных группировок, аминогидроксиэтиленовую группу —CH(NH₂)CH(OH)—, амиды и имиды аминокислот и некоторые другие соединения. Продукты реакции в этом случае имеют фиолетовую или синюю окраску. В условиях биуретовой реакции белки дают фиолетовую окраску, что использовалось для их качественного и количественного анализа.

28 Строение и свойства аминокислот

1. Общие структурные особенности аминокислот, входящих в состав белков

Общая структурная особенность аминокислот - наличие амино- и карбоксильной групп, соединённых с одним и тем же ?-углеродным атомом. R - радикал аминокислот - в простейшем случае представлен атомом водорода (глицин), но может иметь и более сложное строение.

В водных растворах при нейтральном значении рН ?- аминокислоты существуют в виде биполярных ионов.

В отличие от 19 остальных ?-аминокислот, пролин - иминокислота, радикал которой связан как с ?-углеродным атомом, так и с аминогруппой, в результате чего молекула приобретает циклическую структуру.

19 из 20 аминокислот содержат в ?-положении асимметричный атом углерода, с которым связаны 4 разные замещающие группы. В результате эти аминокислоты в природе могут находиться в двух разных изомерных формах - L и D. Исключение составляет глицин, который не имеет асимметричного ?-углеродного атома, так как его радикал представлен только атомом водорода. В составе белков присутствуют только L-изомеры аминокислот.

Чистые L- или D-стереоизомеры могут за длительный срок самопроизвольно и неферментатив-но превращаться в эквимолярную смесь L- и D-изомеров. Этот процесс называют рацемизацией. Рацемизация каждой L-аминокислоты при данной температуре идёт с определённой скоростью. Это обстоятельство можно использовать для установления возраста людей и животных. Так, в твёрдой эмали зубов имеется белок дентин, в котором L-аспартат переходит в D-изомер при температуре тела человека со скоростью 0,01% в год. В период формирования зубов в дентине содержится только L-изомер, поэтому по содержанию D-аспартата можно рассчитать возраст обследуемого.

Все 20 аминокислот в организме человека различаются по строению, размерам и физико-химическим свойствам радикалов, присоединённых к ?-углеродному атому.