23) Эпифитная микрофлора

На поверхности зерна обитает разнообразная микрофлора. Часть микроорганизмов попадает из ризосферы, часть заносится с пылью и насекомыми. Однако на зерне, как и на всей поверхности растений, развиваются лишь некоторые микроорганизмы так называемые эпифиты.  Эпифитные микроорганизмы, размножающиеся на поверхности стеблей, листьев и семян растений, получили название микроорганизмов филлосферы. Эпифиты питаются продуктами экзосмоса растений. Условия жизни эпифитных бактерий своеобразны. Они довольствуются небольшими запасами питательных веществ на поверхности растений, устойчивы к высоким концентрациям фитонцидов, выдерживают периодические колебания влажности.

Поэтому численность их невелика и видовой состав довольно постоянный. Более 90% эпифитных микроорганизмов составляют гнилостные бактерии. В основном эпифитная микрофлора представлена неспороносными бактериями. Большую часть бактериального населения зерна составляют неспороносные палочки рода Pseudomonas. активно развивающиеся на поверхности растений. Особенно часто встречается Pseudomonas herbicola (Erwinia herbicola), образующая на плотных средах золотисто-желтые колонии. Встречаются также Pseudo¬monas fluorescens, микрококки, молочнокислые бактерии, дрожжи. Бациллы и микроскопические грибы составляют небольшой процент.

В определенных условиях эпифитные микроорганизмы могут быть полезны для растений, так как препятствуют проникновению паразитов в ткани растения. При хранении зерна эпифитные микроорганизмы могут играть отрицательную роль. В зрелом зерне вода находится в связанном состоянии и недоступна микроорганизмам. На таком зерне они находятся в состоянии анабиоза (покоя).

На развитие микроорганизмов на зерне, а следовательно, на сохранность последнего решающее влияние оказывают: влажность, температура, степень аэрации, целостность зерна и состояние его покровных тканей. На зерне с повышенной влажностью микроорганизмы размножаются тем быстрее, чем выше температура.

Развитие микробиологических процессов в хранящемся зерне с повышенной влажностью приводит к заметному, а иногда и к очень значительному повышению температуры. Это явление получило название термогенеза.

24) инокуляция бобовых растений клубеньковыми растениями

Вскоре после того, как М. Бейеринк (1888) изолировал клубеньковые бактерии бобовых растений, возникла идея использовать эти бактерии для улучшения образования клубеньков и усиления фиксации атмосферного азота. Впервые препарат клубеньковых бактерий под названием «нитрагин» был приготовлен в 1896 г. в Германии Ф. Ноббе и JI. Гильтнером. Позднее под различными наименованиями культуры клубеньковых бактерий начали готовить в других странах. В 1906 г. в Англии В. Боттомлей стал производить «нитрагин», в 1907 г. в США Ф. Гаррисон и Б. Барлоу предложили соответствующий препарат «нитрокультура». В том же году в России, Т. Будинов начал применять препарат Rhizobium, именовавшийся здесь «нитрагином».

В настоящее время препараты клубеньковых бактерий широко используют в разных странах под различными названиями. Так, во Франции они именуются N-germ, в Чехословакии — нитразон, в СНГ — нитрагин, ризоторфин и т. д.

Использование препаратов клубеньковых бактерий для заражения семян бобовых растений совершенно необходимо, когда в данной местности вводятся новые культуры бобовых и в составе флоры нет перекрестно заражающихся с ними растений. Такая обстановка возникла в нашей стране при возделывании соевых бобов в новых зонах. При этом клубеньков на корнях бобовых растений практически не было. Инокуляция обеспечивала образование клубеньков и, следовательно, осуществление азотфиксации. В результате увеличивались урожай и содержание белка в растительной массе и зерне.

В целесообразности применения инокуляции для новых культур бобовых растений, а также вновь осваиваемых земельных площадей нет сомнения. Значительно труднее решается вопрос о старопахотных, хорошо окультуренных почвах, на которых уже давно возделываются определенные виды бобовых растений Можно предположить, что в таких почвах уже сложились достаточно стабильные микробные ценозы, в составе которых имеются и клубеньковые бактерии культурных бобовых растений. Нужна ли здесь инокуляция и будет ли она себя оправдывать?

Этот вопрос интересует исследователей давно. Для его проверки были поставлены многочисленные опыты. В европейской части СНГ массовые опыты с инокуляцией разных бобовых культур были проведены Е. Н. Мишустиным и В. В. Бернардом. Результат оказался положительным, и в большинстве случаев инокуляция дала заметное увеличение урожая. Лучший эффект отмечался на кислых почвах.

Как же объяснить положительное действие заражения бобовых растений культурой Rhizobium в тех случаях, когда почвы давно освоены и имеют в составе своей микрофлоры клубеньковые бактерии? Во-первых, в природных условиях может происходить перекрестное заражение, то есть высеваемые бобовые растения заражаются клубеньковыми бактериями близких групп растений, В таких случаях клубеньки хотя и образуются, но функционируют неполноценно. При искусственной инокуляции в корень бобового растения проникает активная раса Rhizobium, нанесенная на высеваемые семена. Во-вторых, клубеньковые бактерии, имеющиеся в почве, не занятой бобовыми растениями, существуют, как обычные сапрофиты. Нередко вследствие ряда причин почва оказывается неблагоприятной средой для клубеньковых бактерий. Их количество существенно уменьшается, а активность снижается. Кислые почвы, например, вредно действуют на азотфиксирующую способность клубеньковых бактерий, и при сапрофитном существовании происходит резкое снижение их ценных свойств. Поэтому в таких случаях естественное заражение не дает эффективного симбиоза, и здесь хорошо использовать препарат Rhizobium.

Массовые опыты с нитрагинизацией, проведенные во Всесоюзном НИИ сельскохозяйственной микробиологии главным образом на территории европейской части страны, показали целесообразность и эффективность рассматриваемого агроприема.

Существенное повышение урожайности от нитрагинизации бобовых культур (люцерны, клевера, люпина, гороха, сои) получено в Сибири в опытах Г. Н. Блинкова.

Довольно широко искусственная инокуляция бобовых культур клубеньковыми бактериями проводится в Чехословакии, Болгарии Польше, а также в США, Канаде, Франции, Швеции и других странах.

Наиболее целесообразно экспериментально установить территориальные зоны, где инокуляция дает хороший результат, Такая работа, например, проведена во Франции лабораторией почвенной микробиологии Национального центра агрономических исследований в Дижоне с люцерной — распространенной здесь бобовой культурой. Выявлено, что инокуляция необходима на кислых почвах, часто она приносит пользу на декальцированных почвах, почвах побережья Атлантического океана и в ряде других мест. Заметного эффекта от заражения не наблюдалось на богатых кальцием и известкованных почвах. В общем, опыт французских исследователей подтвердил точку зрения советских ученых на условия, в которых целесообразна инокуляция.

Следует отметить, что бактеризация не только увеличивает урожай бобовых растений, но и улучшает его качество. В растениях, зараженных активными расами клубеньковых бактерий, значительно больше белка и витаминов группы В.

Поскольку положительное влияние инокуляции распространяется и на корни растений, то после сбора урожая пожнивные остатки более эффективно действуют на последующую культуру севооборота. Таким образом, можно сделать вывод о том, что в значительном числе случаев применение препаратов клубеньковых бактерий целесообразно.

Препарат, содержащий клубеньковые бактерии, готовят разными методами. Чаще всего используют торфяной нитрагин — ризоторфин. Он представляет собой стерилизованный г - облучением низинный торф, к которому добавлены питательные для клубеньковых бактерий вещества. Расфасованную массу выдерживают в термостате для размножения внесенных в нее бактерий. Иногда готовят торфяной препарат, не стерилизуя торф, но вносят в него большое количество клубеньковых бактерий. При изготовлении препарата на почве пользуются нейтральной, богатой органическим веществом стерильной почвой, расфасованной в ту или иную тару. Перед посевом семена бобовых растений обрызгивают водной суспензией того или иного препарата.

Препараты для заражения бобовых растений годны лишь ограниченный срок, так как клубеньковые бактерии постепенно погибают. В СНГ для каждого бобового растения (или узкой группы их) готовят специальный препарат.

В настоящее время широко используют приемы химического протравливания семян для их обеззараживания от болезней и вредителей. Не менее широко применяют также гербициды, инсектициды и т. д. Поэтому возникает вопрос о совместимости химических мер защиты урожая с инокуляцией семян бобовых растений клубеньковыми бактериями. В результате большой экспериментальной работы выявлено, что протравливание семян не исключает применения культур клубеньковых бактерий. Однако необходимо подбирать соответствующие протравители и разделять указанные приемы во времени (см. главу 19),

Для эффективного симбиоза клубеньковых бактерий и бобовых растений необходимо вести систематическую работу по селекции активных и вирулентных культур клубеньковых бактерий, а также бобовых растений, обеспечивающих интенсивную деятельность их симбионтов. Поэтому в решении вопроса о полном использовании азотфиксирующей способности бобовых растений и клубеньковых бактерий большое значение будет иметь объединение усилий микробиологов, генетиков, биохимиков и растениеводов.

Сейчас для инокуляции ольхи и казуарины за рубежом стали приготовлять препараты чистой культуры актиномицета Frankia, образующего клубеньки у этих растений. Эксперименты, проводимые в этом направлении, дают хорошие результаты.

24.Процесс инокуляции представляет собой применение искусственно полученных клубеньковых бактерий рода Rhizobium для улучшения азотфиксации. Инокулянты обычно наносят на семена перед посевом или вносят их в борозду для укладки семян при посеве. Было проведено немало исследований по выявлению эффективности применения инокулянтов в почву, которая уже содержит здоровые бактерии рода Rhizobium. Некоторыми исследованиями было установлено значительное повышение урожайности, тогда как другими рост урожайности зафиксирован не был. Например, исследования австралийских ученых показали, что на почвах с низким или нулевым содержанием бактерий Rhizobium инокуляция может обеспечить существенное повышение уровня образования клубеньков и урожайности растений.

Для бобовых культур повышение уровня образования клубеньков обычно составляет 50-150%, а повышение урожайности - 0,7-2 т/га. На практике в основном применяются четыре основные формы инокулянтов - порошковые, гранулированные, жидкие и замороженные (сухие). Наиболее широко используют порошковые инокулянты на торфяной основе, которые наносят непосредственно на семена. Жидкие инокулянты поступают в виде желе или замороженного концентрата, который обычно смешивают с водой и подают в семенную борозду.

Сыпучая торфяная форма традиционно называется ризоторфином и представляет собой увлажненную сыпучую массу темно-бурого цвета - в 1 г ее содержится 10-15 млрд ризобий, которые размножены в стерильном торфе с добавками питательных ингредиентов и мела. Масса гектарной дозы ризоторфина - 200 г. Гарантированный срок хранения препарата при температуре 4-15 °С составляет 6-9 месяцев.

Для того чтобы частицы торфа и вермикулита лучше удерживались на поверхности обработанных семян, к водной суспензии препарата добавляют прилипатели (жидкий или твердый концентрат барды, патоку, клейстер, латекс, обрат, навозную жижу). При этом нельзя использовать силикатный клей - он токсичен для клубеньковых бактерий из-за щелочной реакции раствора.

Инокуляцию семян биопрепаратами клубеньковых бактерий осуществляют машинами для протравливания семян ПСШ-5, ПС-10, «Мобитокс». Перед работой емкости машин очищают от остатков ядохимикатов, промывают раствором соды, стирального порошка и чистой водой согласно санитарным требованиям. Жидкую форму препарата заливают в бак вместе с водой, а сыпучие формы перед заправкой в бак протравочной машины необходимо предварительно суспензировать в небольшом количестве воды в отдельной емкости (ведро, бочка) и очистить от крупных частиц через фильтр с отверстиями 1-2 мм или через марлю. Хорошие результаты получаются и при обработке семян во вращающихся барабанах или бетономешалках.

Применение специальных аппликаторов позволяет использовать обычные погрузчики семян со шнековыми и ленточными транспортерами. Инокуляцию семян бобовых культур биопрепаратами клубеньковых бактерий следует проводить в тени навеса или на складе, чтобы избежать действия прямых солнечных лучей, которые губительны для микроорганизмов. Нельзя обрабатывать семена в семенных ящиках сеялки, потому что жидкий инокулюм стекает на дно и нарушает работу высевающих аппаратов. Кроме того, увлажненные таким образом семена теряют сыпучесть и образуют «своды».

Бобово-ризобиальный симбиоз очень чувствителен к пестицидам. Все протравители в той или иной степени ингибируют образование клубеньков и снижают их азотфиксирующую активность. К наименее токсичным относятся фундазол, витавакс и бавистин. Вместо химических фунгицидов для подавления корневых гнилей и других заболеваний люцерны и эспарцета целесообразно использовать препараты микроорганизмов - антагонистов фитопатогенов.

Оболочка семян люцерны, донника и козлятника содержит токсичные для клубеньковых бактерий вещества, в частности алкалоиды, и более половины нанесенных на семена бактерий гибнет в течение двух часов после инокуляции. Еще более токсичны для клубеньковых бактерий семена люцерны, обработанные специальными составами для магнитной сепарации от семян повилики. Протравливание фунгицидами и обработка микроэлементами семян бобовых трав также существенно снижают выживание клубеньковых бактерий на их поверхности - вплоть до их полной гибели.

Вполне эффективным способом инокуляции является внесение как жидкого, так и гранулированного инокулянта в борозду для укладки семян.

При этом способе повышенные дозы бактерий могут быть внесены непосредственно в корневую зону растений, где бактерии защищены от разрушающих факторов - высоких температур поверхностного слоя почвы, нехватки влаги на поверхности почвы и повышенной концентрации химических препаратов.

Таким образом, бобовые растения обладают уникальной способностью вступать в симбиоз со специфическими для каждого вида растений клубеньковыми бактериями, образовывать азотфиксирующие клубеньки, усваивать за вегетацию до 500 кг/га азота воздуха (N2) и превращать его в аммиачный азот, доступный для растений. Фиксация бобовыми растениями атмосферного азота обеспечивает высокие урожаи дешевого растительного белка без применения дорогостоящих и экологически небезопасных минеральных азотных удобрений.

Препарат нитрагин производятся на основе активных жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium. Эти бактерии в симбиозе с бобовыми культурами способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая его в соединения, легкоусвояемые растением. Сухой нитрагин - порошок светло-серого цвета, содержащий в не менее 9 млрд. жизнеспособных бактерий в смеси с наполнителем. Влажность не превышает 5-7%. Промышленное производство имеет типичную схему. Необходимо отметить, что важно подбирать штаммы, устойчивые к высушиванию. Для производства посевного материала исходную культуру клубеньковых бактерий выращивают на агаризованной среде, содержащей отвар бобовых семян, 2% агара и 1% сахарозы, затем культуру размножают в колбах на жидкой питательной среде в течение 1-2 суток при 28-30оС и рН 6.5-7.5. На всех этапах промышленного культивирования применяют питательную среду, включающую такие компоненты, как меласса, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двузамещенный фосфат калия. Основная ферментация идет при тех же условиях в течение 2-3 суток. Готовую культуральную жидкость сепарируют, получается биомасса в виде пасты с влажностью 70-80%. Пасту смешивают с защитной средой, содержащей тиомочевину и мелассу (1:20) и направляют на высушивание. Сушат путем сублимации (в вакуум-сушильных шкафах). Высушенную биомассу размалывают. Производительнее высушивание в распылительных сушках, но при этом 75% клеток теряют жизнеспособность. Препараты сухого нитрагина фасуют и герметизируют в полиэтиленовые пакеты по 0.2 - , хранят при температуре 15оС не более 6 месяцев. Семена опудривают перед посевом.