6.2. Властивості ферментів. Ферментативна кінетика

Специфічність дії ферментів

Просторова відповідність субстрату і активного центру є обов’язковою умовою ферментативного каталізу. Деякі ферменти каталізують перетворення лише однієї певної речовини, тобто проявляють абсолютну специфічність. Наприклад, фермент уреаза каталізує розщеплення амідного зв’язку лише в сечовині -H₂N-CO-NH₂ - і не діє на амідні зв’язки в інших сполуках.

Ферменти, які каталізують перетворення оптично активних речовин проявляють стереоспецифічність. Наприклад, -глюкозидази каталізують розщеплення у вуглеводах лише  -глікозидних зв’язків, а  -глюкозидази діють лише на -глікозидні зв’язки.

Багато ферментів діє на певний хімічний зв’язок, або на певну хімічну послідовність в різних молекулах певного класу. Така специфічність називається груповою. Так, хімотрипсин, дія якого описана вище, діє на пептидні зв’язки в різних пептидах, але лише при умові, що карбонільна група зв’язку належить ароматичній амінокислоті. Фермент пепсин розщеплює пептидні зв’язки лише між двома гідрофобними амінокислотами, трипсин - пептидні зв’язки, карбонільна група яких належить аргініну або лізину. Амінопептидаза відщеплює останній з N-кінця амінокислотний залишок, а карбоксипептидаза – останній з С-кінця, діючи на різні білки.

Активність ферментів і концентрація субстратів. Ферментативна кінетика

Важливою характеристикою ферменту є активність. Її вимірюють за зміною концентрації субстрату або продукту каталізу за одиницю часу. За одиницю активності ферменту приймається така активність, при якій здійснюється перетворення 1 мкмоль речовини за 1 хвилину при 25°С в оптимальних умовах дії ферменту. Активність ферментів вимірюють при оптимальному рН і концентрації субстрату, близькій до насичуючої, тобто при умові, що концентрація ферменту є єдиним лімітуючим фактором реакції. Звичайно визначають питому активність, тобто активність ферменту в розрахунку на 1 мг білка. Більш наочним показником активності є число обертів ферменту, яке показує, скільки молекул субстрату перетворюється одним активним центром ферменту (або однією молекулою ферменту) за одиницю часу. Наприклад, карбоангідраза, яка каталізує реакцію гідратації вуглекислого газу в крові (СО₂ + Н₂О  Н₂СО₃), перетворює 36 млн молекул вуглекислого газу за 1 хвилину. Без ферменту ця реакція відбувається дуже повільно. Карбоангідраза - один з найактивніших ферментів. Для ферментів, які розщеплюють полісахариди, число обертів становить: для -амілази - 1 100 000 і для -амілази - 12 500 на одну молекулу ферменту. Каталаза, яка розкладає пероксид водню, має число обертів 18 млн.

При надлишку субстрату швидкість реакції залежить від каталітичної здатності самого ферменту, тобто від того, наскільки швидко фермент може перетворити одну молекулу субстрату і вивільнитись для перетворення іншої. Швидкість реакції в цих умовах є максимальною (V_max). При менших концентраціях субстрату швидкість реакції (V₀) зростає пропорційно збільшенню його концентрації. Кількісно залежність швидкості від концентрації субстрату і властивостей самого ферменту виражаться рівнянням:

де К_m - константа Міхаеліса – Ментен, яка характеризує співвідношення коефіцієнтів розпаду (k_-1 і k₂) та утворення (k₁) фермент-субстратного комплексу:

Чисельно вона відповідає концентрації субстрату, при якій швидкість реакції дорівнює половині максимальної (рис 6.1.А.). Графічно значення V_max і K_m зручно обчислювати за рівнянням, оберненим до виразу V₀ (метод подвійних обернених величин Лайнуївера – Берка) (рис. 6.1.Б.):

В умовах клітини концентрації субстратів можуть істотно коливатись впливати на швидкість реакцій.

Вплив температури

При оптимальних для життя температурах дуже мала кількість реагуючих молекул знаходиться в активованому стані. Тому і перетворення їх неферментативним шляхом в організмі практично не відбуваються. Якби температура живих істот могла збільшуватись на десятки градусів, кількість активних молекул, а отже і швидкість їх перетворення, зросли би так сильно, щоби не вистачило запасів кисню і їжі для забезпечення стабільного стану організму.

Ферменти, як і всі білки, є термолабільними, їх активність у більшості ферментів найвища при температурах, близьких до 40⁰ (рис. 6.2.). Зміна температури впливає на слабкі взаємодії, які підтримують специфічну просторову форму молекули ферменту і беруть участь у взаємодії із субстратом. Причому стабільність водневих і електростатичних взаємодій послаблюється при нагріванні, а гідрофобних - при охолодженні. Отже, вплив температури на кожний конкретний фермент залежить від того, які саме слабкі взаємодії зумовлюють його активність.

Вплив кислотності середовища

Ферменти найкраще функціонують в досить обмеженому діапазоні рН середовища - оптимумі рН. Причому для різних ферментів його значення відрізняються (рис. 6.3.). Оптимум рН часто знаходиться в області ізоелектричної точки білка - фермента і може не співпадати з кислотністю середовища. Ця залежність пов’язана з необхідністю підтримання іонізованого стану функціональних груп ферменту і субстрату для забезпечення фермент-субстратної взаємодії.

Інгібітори ферментів

В біологічному каталізі вирішальне значення має можливість тонкої його регуляції залежно від потреб організму. Максимальна швидкість перетворення субстратів ферментами використовується організмом так само рідко, як і гучне звучання музичного інструменту професійним музикантом.

Регуляція активності ферментів може здійснюватись у двох напрямках - активації (прискорення) і інгібування (гальмування). Регуляторами активності часто виступають різні хімічні речовини -продукти обміну речовин (природні регулятори) і чужорідні сполуки (ліки, добавки до їжі, хімічні забруднювачі середовища).

Інгібітори ферментів поділяють за механізмом дії на конкурентні і неконкурентні. Конкурентні інгібітори часто за будовою, просторовою формою подібні на субстрат і конкурують з ним за активний центр ферменту. Зв’язування їх в активному центрі за просторовою відповідністю приводить до інактивації ферменту - неможливості приєднувати і перетворювати субстрат.

Популярний приклад конкурентних інгібіторів - це лікарські препарати сульфаніламіди. Вони структурно подібні на п-амінобензойну кислоту (ПАБК), яка необхідна для росту деяких хвороботворних бактерій (див. вітамін В_С):

п-амінобензойна кислота сульфаніламіди

Зараз випробувано біля 10 000 сульфаніламідних препаратів, які мають антибактеріальну активність.

Велика група речовин, що містять основний атом азоту, є конкурентними інгібіторами нервово-паралітичної дії, оскільки вони інактивують холінестеразу, тобто протидіють розщепленню ацетилхоліну, який утворюється внаслідок нервового імпульсу. До них належать зміїні отрути, алкалоїди, нікотин, морфін, кокаїн та інші.

Неконкурентні інгібітори зв’язуються як з ферментом, так і з фермент-субстратним комплексом. Вони взаємодіють не з активним центром, а з іншими ділянками молекул ферменту, деформуючи його просторову структуру, що робить неможливим каталіз. Неконкурентними інгібіторами є йони важких металів, наприклад, Ag⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, які реагують з сульфгідрильними групами ферментів, а також хелатоутворюючі речовини, які зв’язують йони металів - активаторів ферментів.

За міцністю взаємодії розрізняють зворотні і незворотні інгібітори. Зворотні інгібітори можуть вивільнюватись з комплексу з ферментом. Зворотню дію має багато конкурентних інгібітори. В присутності великих концентрацій субстрату вони витісняються з активного центру ферменту.

Незворотні інгібітори утворюють ковалентні зв’язки з ферментом або в активному центрі, або в іншій частині його молекули. Таким інгібітором є йодоацетат, або йодоацетамід, який утворює міцний зв’язок з сульфгідрильною групою або імідазолом ферменту незалежно від місця його знаходження, наприклад:

R-SH + I-CH₂CONH₂  R-S-CH₂CONH₂ + HI

Окисно-відновні ферменти, які діють за участю йону металу, гальмуються ціанамідом, сірководнем, оксидом вуглецю (П).

Незворотню дію на холестерази проявляють фосфоорганічні речовини типу (RO)₂PХО, які можна розглядати як похідні ортофосфорної кислоти, де R алкільні радикали (різної будови), а X - F, або CN, наприклад:

схема будови зарин табун

Вони токсичні для центральної нервової системи, застосовуються як інсектициди, хімічна зброя, в клінічній медицині.

Активація ферментів здійснюється різними шляхами. Ферменти можуть переходити в активний стан при взаємодії з якоюсь речовиною - активатором. Так діють на фермент кофактори простої будови. Вони, зв’язуючись з ферментом, переводять його в активний стан, але самі не беруть безпосередньої участі у взаємодії з субстратом. Різні неорганічні аніони (Cl^- та інші) виступають малоспецифічними активаторами. Значно більш специфічними є катіони металів.. Вони діють на один або декілька ферментів. Так Мg²⁺ активує ферменти, які діють на фосфорильовані субстрати і часто може замінятись Mn²⁺. Принаймні 13 інших катіонів також є активаторами: Na⁺, К⁺, Rb⁺, Cs⁺, Са²⁺, Zn²⁺, Cr³⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Al³⁺, NH₄⁺. Один з ферментів обміну пептиду глутатіону активується селеном

Іншим шляхом активації є відщеплення олігопептиду від неактивної форми ферменту (проферменту). За таким принципом активуються ферменти - гідролази, які діють поза клітинами - в травному тракті або плазмі крові. Вони утворюються в клітинах залоз в неактивній формі і лише після виходу з клітини під дією іншого ферменту відщеплюють частину молекули і набувають активної форми. Прикладами таких ферментів є трипсиноген і хімотрипсиноген, які синтезуються підшлунковою залозою і активуються в тонкому кишечнику. Якби в клітинах утворювалась відразу активна форма ферменту, то вона руйнувала би саму клітину.

Алостерична регуляція

Перетворення певної речовини в організмі звичайно здійснюється в декілька стадій, причому продукт перетворення однієї стадії стає субстратом іншої. Узгоджена дія такого ланцюга перетворень, тонка і економна регуляція його інтенсивності, здійснюється завдяки алостеричним регуляторним ферментам. Вони, звичайно, займають ключове місце в ланцюгу перетворень, завдяки чому від їх активності залежить не одна чи дві ланки ланцюгу, а весь багатоетапний процес. Регуляція їх здійснюється шляхом приєднання до алостеричного центру ферменту речовини - регулятора, що приводить до зміни просторової форми фермента. Інгібітори алостеричних ферментів звичайно є кінцевими продуктами процесу. Таким чином, накопичення кінцевого продукту приводить до зупинки перших стадій його утворення, чим досягається економне використання субстратів і енергії. Отже, алостеричне гальмування здійснюється за принципом негативного оберненого зв’язку. Алостеричними активаторами виступають субстрат або попередники субстрату ланцюга перетворень, тобто алостерична регуляція здійснюється за принципом позитивного прямого зв’язку:

Взаємодія цих двох систем регуляції ключових ферментів забезпечує точно збалансований регуляторний механізм дії, конкретні приклади якого ми розглянемо при вивченні обміну речовин.

Звичайно алостеричні ферменти складаються з кількох субодиниць. При дії активатора зростає їх кооперативність взаємодії і спорідненість до субстрату. Алостеричні інгібітори спричиняють утворення малоактивної форми ферменту.