6. Ферменти
В живих організмах переважна більшість реакцій відбувається за участю ферментів - біологічних каталізаторів білкової природи. Назва “ферменти” походить від латинського “fermentatio” - бродіння, кипіння. Інша, поширена в світовій літературі, назва ферментів – ензими – походить від грецького “en zyme” - в дріжджах. Обидва терміни свідчать про те, що властивість живих клітин прискорювати хімічні процеси здавна відома людям.
Виділити ферменти в чистому вигляді вдалося лише в XX столітті. В 1902 р. в лабораторії І. П. Павлова були одержані важливі докази білкової природи ферменту травлення пепсину. В 1926 р. Дж. Самнер виділив у кристалічному вигляді фермент уреазу, який каталізує розщеплення сечовини на аміак і вуглекислий газ, і довів, що це білок. Через чотири роки Дж. Нортроп виділив кристали пепсину. На наш час відомо більше 2000 ферментів і всі вони мають білкову структуру.
6.1. Будова і механізм дії ферментів
Деякі ферменти є простими білками. До них належать ферменти, які каталізують реакції гідролізу. Інші, складні білки, містять два компоненти - білковий (апофермент) і небілковий (кофактор). Кофактор може бути простий (неорганічної природи, наприклад, Fe2+, Fe3+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Mo, Se), або складний (органічної природи). Складні кофактори називаються коферментами. Часто вони представлені вітамінами (В1, В6, ВС, В12, Н), або до їх складу входять вітаміни (до НАД+, НАДФ+ - В5, до ФАД, ФМН – В2, до КоАSH – В3).
Кофактор і апофермент можуть з’єднуватись міцними ковалентним зв’язком, або легко відокремлюватись і існувати самостійно. Кофактор, який міцно зв’язаний з апоферментом, називається простетичною групою. Каталітичну активність компоненти ферменту проявляють не поокремо, а лише в об’єднаній структурі, яка називається холоферментом.
Ферменти - це глобулярні білки. За розмірами вони часто значно перевищують речовину, яку перетворюють (субстрат). Безпосередня взаємодія між ферментом і субстратом під час каталізу відбувається в певній ділянці молекули - активному центрі. Кофактор входить до складу цієї молекулярної ділянки.
Багато ферментів не лише каталізують реакції обміну речовин, але і регулюють швидкість їх протікання. Такі ферменти називаються регуляторними. Вони містять ділянку зв’язування речовин-регуляторів, яка називається алостеричним центром (від грецьких слів “allo” i “stereos”, що означає - інший центр).
Ферменти, як і всі каталізатори, зменшують енергію активації реакції за рахунок утворення проміжного комплексу з субстратом перетворення. На відміну від процесів в неживій природі, в фізіологічних умовах це єдиний спосіб забезпечити протікання процесів. Ферментативний каталіз відбувається в декілька стадій. На першій стадії фермент (F) взаємодіє з субстратом (S), утворюючи фермент-субстратний комплекс (FS). На другій стадії відбувається активація субстрату у складі комплексу (FS*). На третій стадії активований субстрат в складі комплексу перетворюється в продукт (FP) і, нарешті, на четвертій стадії продукти реакції вивільняються, а фермент може здійснювати новий цикл перетворень:
F + S FS FS* FP F + Р
Фермент-субстратний комплекс нестабільний. В більшості випадків його неможливо виділити, а можна лише зареєструвати за допомогою фізичних методів дослідження швидких реакцій.
Молекулярні процеси, які відбуваються під час біокаталізу, досить детально вивчені. Розглянемо їх постадійно.
І стадія
Субстрат зближується з активним центром ферменту і орієнтується по відношенню до каталітичної групи. Відбувається зв’язування субстрату в активному центрі. Орієнтуюча група субстрату і зв’язуюча ділянка активного центру мають просторову і хімічну відповідність. Наприклад, фермент хімотрипсин, який розщеплює пептидні зв’язки, діє лише в тому випадку, коли карбонільна група пептидного зв’язку належить залишку ароматичної амінокислоти (триптофану, тирозину або фенілаланіну). Ці групи просторово відповідають гідрофобній “кишені”, щільно прилягають до неї і орієнтують поліпептидний ланцюг в активному центрі.
П стадія
Один з перших дослідників білків Е. Фішер вважав, що фермент “жорстко” відповідає за формою субстрату, як замок борідці ключа (модель “ключа і замка”). Але ця модель не пояснює механізму активації субстрату. Сучасна модель відповідності ферменту і субстрату (модель “руки і рукавички”) пояснює її так: фермент, зв’язаний з субстратом, деформується і пристосовується до нього, як рукавичка до руки. Виникає індукована відповідність між ферментом і субстратом. Напруження передається від ферменту до субстрату і комплекс переходить в активований стан (FS*). Енергія активації субстрату в цьому комплексі значно менша, ніж у відсутність каталізатора.
На Ш стадії відбуваються хімічні взаємодії між активованим субстратом і функціональними групами активного центру. Виділяють два види взаємодій: кислотно-основні і ковалентні. Кислотно-основні взаємодії здійснюють ферменти, в активних центрах яких містяться радикали амінокислот, що можуть виступати акцепторами або донорами протонів:
Протон-донорні групи |
Протон-акцепторні групи |
-СООН |
-СОО- |
-NH3+ |
-NH2 |
-SH |
-S- |
-імідазолН+ |
-імідазол |
Ковалентні взаємодії, які можуть виникати між групами активного центру і субстрату, є нетривкими, але їх утворення приводить до розриву зв’язку в молекулі субстрату. Нестабільний новоутворений зв’язок легко гідролізується з утворенням продуктів.
Розглянемо хімічні взаємодії, які виникають при розщепленні пептидного зв’язку ферментом хімотрипсином. Цей фермент складається з трьох субодиниць: А, В і С. Хімічні зв’язки в активному центрі утворюють залишки гістидину-57 і аспарагінової кислоти-102 В-субодиниці і серину-195 С-субодиниці.:
Пептидний зв’язок субстрату утворює ковалентний зв’язок за рахунок атому С з атомом О серину активного центру. Така реакція відбувається легко завдяки тому, що Н гідроксильної групи серину сильно притягується до імідазольної групи гістидину (кислотно-основна взаємодія). Утворення фермент-субстратного ковалентного зв’язку приводить до розриву пептидного зв’язку і видалення першого продукту реакції зі звільненою аміногрупою:
Фермент-субстратний зв’язок легко піддається гідролізу з вивільненням другого продукту. У вільному активному центрі гідроген знову приєднується до серину. Дисоційована карбоксигрупа аспарагінової кислоти, можливо, посилює кислотно-основні взаємодії і сприяє виштовхуванню другого продукту з комплексу:
