4. Нуклеїнові кислоти

Нуклеїнові кислоти – це біополімери, які виконують найважливіші біологічні функції – збереження спадкової інформації та її реалізації протягом життя клітини. У більшості організмів функцію збереження спадкової інформації виконує ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота). При поділі клітин дочірні клітини одержують точну копію спадкової інформації. Різні види РНК (рибонуклеїнових кислот) забезпечують реалізацію спадкової інформації в клітині протягом її існування шляхом участі в синтезі специфічних білків, закодованих в структурі ДНК. За хімічною будовою нуклеїнові кислоти є полінуклеотидами, а за хімічним складом характеризуються постійним вмістом фосфору (8 – 10%) і нітрогену (15 – 16% за масою).

4.1. Мононуклеотиди

Мононуклеотиди складаються з трьох компонентів: залишків азотистої основи, пентози та ортофосфорної кислоти. Це найбільш складно побудовані мономери з тих, що утворюють біомолекули. До складу нуклеїнових кислот входять азотисті основи двох типів – пуринові і піримідинові. Нуклеотиди, які не утворюють полімерів, наприклад деякі коферменти, містять інші нітрогеновмісні гетероцикли, що проявляють основні властивості (наприклад, нікотинамід). Азотисті основи є похідними гетероциклів пурину і піримідину. До складу нуклеїнових кислот входять пуринові основи аденін і гуанін і піримідинові – тимін, цитозин, урацил:

Крім них є основи, які рідко зустрічаються, і тому названі мінорними, наприклад:

Вони виконують специфічні функції в нуклеїнових кислотах.

Азотистим основам властива кето-енольна таутомерія. В складі нуклеотидів вони знаходяться в кетоформі і лише в ній можуть утворювати характерні водневі зв’язки, стабілізуючі полімер, а піримідинові основи і зв’язки з пентозою.

Сполука, утворена азотистою основою і залишком пентози – рибози або дезоксирибози, називається нуклеозидом. Це -глікозид, в якому пуринова основа утворює зв’язок по атому азоту N9, а піримідинова – N1, наприклад:

В залишках пентози атоми карбону позначають номером із штрихом, наприклад, 3^/, щоби не плутати нумерацію атомів в пентозі і основі.

Мононуклеотиди є фосфатними естерами нуклеозидів – нуклеозидмоно-, ди- або трифосфатами:

Назви нуклеозидів і нуклеотидів наведені в таблиці 4.1.

Таблиця 4.1. Номенклатура нуклеозидів і 5^/-рибонуклеотидів

Азотиста основа (укр. і. англ. позначення)	Нуклеозид	Рибонуклеотид*3
Аденін (А, А)	Аденозин	Аденілова кислота, 5/-аденозинмононуклеотид**4, 5/-АМФ
Гуанін (Г, G)	Гуанозин	Гуанілова кислота, 5/-гуанозинмонофосфат, 5/-ГМФ
Цитозин (Ц, С)	Цитидин	Цитидилова кислота, 5/-цитидинмонофосфат, 5/-ЦМФ
Урацил (У, U)	Уридин	Уридилова кислота, 5/-уридинмонофосфат, 5/-УМФо
Тимін (Т, Т)	Тимідин	Тимідилова кислота, 5/-тимідинмонофосфат, 5/-ТМФ***5

Теоритично фосфатні естери можуть утворюватись за будь-якою з вільних гідроксильних груп залишку пентози. В організмі переважно містяться 5^/-нуклеозидфосфати.

Нуклеозидфосфати, крім того, що утворюють полінуклеотиди, виконують важливі самостійні біологічні функції. Нуклеозидтрифосфати служать вихідними активними формами, що використовуються в біосинтезі полінуклеотидів. Нуклеозидтрифосфат АТФ відіграє центральну роль в енергообміні клітин. Енергоносіями і активаторами в різних біологічних процесах є і інші нуклеозидтрифосфати ҐТФ (біосинтез білка), ЦТФ (біосинтез фосфоліпідів), УТФ (біосинтез полісахаридів і гліколіпідів. Нуклеозиддифосфати також можуть використовуватись в енергозабезпеченні організму. Циклічні нуклеозидмонофосфати – 3^/,5^/-цАМФ і 3^/,5^/-цГМФ є регуляторами обмінних процесів, посередниками дії в клітині певних гормонів, які не проникають в неї через мембрану, наприклад адреналіну.

Слід зауважити, що при рН, близькому до нейтрального, фосфорильні залишки нуклеотидів дисоційовані і несуть негативний заряд, що надає особливих властивостей молекулам.

При конденсації двох мононуклеотидів утворюється динуклеотид, причому реалізуються два типи сполучення: а) фосфодиефірний зв’язок, б) пірофосфатний зв’язок:

Динуклеотид, утворений за допомогою фосфодиефірного зв’язку, можна продовжити (наростити) з обох боків з утворенням полінуклеотидного ланцюга. Оскільки напрямок нарощування ланцюга має при біосинтезі велике значення, кінцевий нуклеотидний залишок, що містить фосфат в 5^/-положенні називають 5^/-кінцем молекули, а залишок нуклеотиду, який має вільний гідроксил в 3-му положенні пентози – 3^/-кінцем молекули. Приєднання наступного мононуклеотиду до 3^/-кінця молекули означає нарощування ланцюга в напрямку 5^/3^/. В такому напрямку нарощуються полінуклеотидні ланцюги в живих системах.

До динуклеотидів, побудованих за допомогою пірофосфатного зв’язку, належать, наприклад, коферменти НАД⁺, НАДФ⁺, ФАД.

4.2. ДНК

Перший дослідник нуклеїнових кислот, швейцарський лікар Фрідріх Мішер виділив у 1868 році з ядер гною так званий нуклеїн - комплекс нуклеїнових кислот та білків. Відокремити нуклеїнові кислоти тваринних клітин від білків вдалося вперше Р. Альтману, а рослинних клітин – А. М. Білозерському. Р. Альтман також довів, що нуклеїн має кислі властивості і запропонував у 1889 р. назву - нуклеїнові кислоти.

На початку XX ст. вже був відомий нуклеотидний склад нуклеїнових кислот та спосіб об'єднання мононуклеотидів між собою. Однак уявлення про просторову структуру нуклеїнових кислот та їх роль в збереженні та реалізації спадкової інформації живих організмів сформувались лише порівняно недавно, в 50-ті роки. До цього вважалось, що загадка спадковості пов'язана з білками, і варто вивчити структуру білків, як молекулярні основи спадковості стануть зрозумілими. Але сталося так, що хімічна природа спадкового матеріалу була доведена ще раніше, ніж з’ясували просторову структуру білків.

Вирішальним в доведенні спадкової функції нуклеїнових кислот був дослід А. Херші і М. Чейз, які за допомогою радіоактивної кишкової палички (Escherichia coli) в клітину попадає саме нуклеїнова кислота віруса, а не його білок.

В переважній більшості організмів функцію збереження спадкової інформації відіграє ДНК. Вміст ДНК в різних клітинах організму однаковий і лише в статевих клітинах - вдвічі менший. В клітинах ссавців міститься 6-710^-12 г ДНК, бактерій–0,0110^-12. В клітині ДНК зосереджена в ядрі, а також міститься у незначній кількості в мітохондріях і хлоропластах.

До складу ДНК входять азотисті основи аденін, гуанін, тимін, цитозин і пентоза дезоксирибоза.

В 1950 році Ервін Чаргафф із співробітниками встановили кількісні співвідношення, які носять назву правил Чаргаффа:

1. Кількість пуринових основ в ДНК дорівнює кількості піримідинових основ (А+Г=Т+Ц).

2. Кількість аденіну в ДНК дорівнює кількості тиміну (A=Т).

3. Кількість гуаніну в ДНК дорівнює кількості цитозину (Г=Ц).

До цих правил можна додати ще одне співвідношення, встановлене А.М.Білозерським: кількісне співвідношення (Г+Ц)/(А+Т) є постійним для певного виду організмів, а отже, може служити видовою характеристикою. Для тварин це співвідношення становить 1,3 – 1,5, рослин – 1,1 – 1,7, і найбільший діапазон має для бактерій: від 0,35 до 2,7.

Структура ДНК

Молекули ДНК дуже великі, навіть в порівнянні з іншими біополімерами. Так ДНК з клітини людини містить близько трьох трильйонів азотистих основ. Тому їх структуру доцільно зображати за допомогою поняття про рівні укладки.

Первинна структура ДНК - це послідовність мононуклеотидних залишків у полінуклеотидному ланцюгу. Полінуклеотид можна зобразити схематично, позначивши азотисті основи першими буквами їх українських або міжнародних назв, пентози – прямою лінією, а 3^/-5^/-фосфодиестерні зв’язки – косими лініями з буквою Ф (Р) посередині:

5^/-кінець 3^/-кінець.

Цій схемі відповідає короткий запис: фАфЦфГфЦфТ (pApCpGpCpT), або АЦГЦ Т (AUCGCT).

Розшифровка первинної структури молекули ДНК вперше була здійснена Ф. Сенгером (1977 р.), який за цю роботу одержав свою другу Нобелевську премію. Зараз первинну структуру ДНК визначають за допомогою прилада секвенатора, який автоматично розшифровує біля одного млн нуклеотидів за добу. Одним із прикладів практичного застосування знань про первинну структуру ДНК є реконструкція ходу еволюції на підставі порівняння нуклеотидних послідовностей ДНК різних видів.

В первинній структурі ДНК відкриті ділянки паліндроми, тобто послідовності, які однаково читаються в прямому і оберненому напрямі. Відомими прикладами паліндромів у мові є “А роза упала на лапу Азора”, “Аргентина манит негра”,“Madam, in Eden I’m Adam”. Паліндроми мають внутрішню вісь симетрії відносно якої можуть утворюватись комплементарні (див. нижче) вирости – “шпильки”, які виконують регуляторну роль.

Вторинна структура ДНК була розшифрована на основі рентгеноструктурного аналізу і співставлення його результатів з кількісними співвідношеннями, виведеними Е. Чаргаффом. Застосування рентгеноструктурного аналізу, успішне для білка, у випадку ДНК ускладнилось тим, що довгий час не вдавалось виділити її кристали.

В результаті довготривалої копіткої праці М. Уілкінса, Р. Франклін та інш. була одержана велика кількість рентгенівських знімків, які фіксували взаємне розташування частинок в різних ділянках ДНК. Найбільш вдала рентгенограма Р. Франклін (Рис. 4.1.) демонструє хрестоподібне розташування рефлексів, що вказує на спіральну структуру. Затемнені зони відповідають основам, які ідуть одна за іншою.Аналіз цих знімків був блискуче виконаний Джоном Уотсоном і Френсісом Кріком. В результаті в 1953 р. була сформульована гіпотеза про подвійну спіраль. Вона добре узгоджувалась з фактичними даними і пояснювала функції ДНК. Запропоновану структуру з деякими виправленнями приймають і зараз, а Ф. Крік, Дж. Уотсон і М. Уілкінс одержали в 1962 р. Нобелівську премію за встановлення молекулярної структури ДНК і її ролі в передачі генетичної інформації.

Вторинна структура ДНК представляє собою подвійну спіраль, утворену двома антипаралельними полінуклеотидними ланцюгами. Цю структуру часто порівнюють з гвинтовими сходами, в яких “сходинки” утворені азотистими основами, оберненими назустріч одна іншій всередину, а “обіччя” - це залишки пентози і фосфату, що чергуються (Рис. 4.2.)

Напроти аденіну завжди розташовується тимін, а напроти гуаніну - цитозин, що узгоджується з правилами Чаргаффа. Така строга просторова відповідність азотистих основ називається комплементарністю. Обидва ланцюги молекули, в цілому, комплементарні, тобто доповнюють один одного. Завдяки комплементарності всі "сходинки" спіралі мають однакову ширину – її діаметр становить 2,0 нм.. Спіраль стабілізується водневими зв'язками між комплементарними основами: двома між аденіном і тиміном і трьома між гуаніном і цитозином:

Між площинами ароматичних кілец існують також гідрофобні, так звані “стекінг” - взаємодії, завдяки яким пари основ утримуються як стовпчик монет.

Спіраль правозакручена, плектономічна, тобто ланцюги не можна роз'єднати, не розкрутивши спіраль. Відомі розміри спіралі: відстань між парами азотистих основ складає 0,34 нм, а на один оберт спіралі, висота якого 3,4 нм, припадає 10 нуклеотидних пар

Зараз відомо декілька форм спіралі, які, ймовірно, відповідають різним функціональним станам ДНК. Так, описана вище В-форма, як вважають, сприятлива для подвоєння ДНК. Більш компактна форма А (з розташуванням основ під нахилом і 11 парами основ на виток) ймовірно утворюється при біосинтезі РНК, а більш розтягнена форма С типова для інертного хроматину. Форми А і С правоcпіральні. Відома також лівоспіральна зигзагоподібна форма Z, яка може виконувати роль регуляторного сигналу.

Відкриття Уотсона і Кріка привело до створення нової природничої науки - молекулярної біології, яка розкриває молекулярні механізми біологічних функцій і робить можливим практичне втручання в ці процеси. Термін "молекулярна біологія” ввів у 1940 р. У. Астбюрі, який вперше висунув припущення про тримірну структуру ДНК.

Третинна структура ДНК. Розрахунки показують, що подвійна спіраль ДНК з ядра однієї клітини людини займає відстань 1,8 м. Зрозуміло, що в ядрі діаметром 5 мк вона повинна бути укладена дуже компактно у третинну структуру. Така структура у еукаріот утворюється за участю молекул білків. В результаті формується нуклеопротеїд хроматин. Укладка досягається шляхом суперспіралізації і здійснюється в три етапи: Перший, нуклеосомний підрівень нагадує буси, де кожна бусинка - це нуклеосома, яка формується накручуванням подвійної спіралі ззовні, як нитки на котушку, на октамери (поєднання вісьми молекул) білків гістонів. Кожна нуклеосома має діаметр 10 - 11 нм і містить до 160 нуклеотидних пар. 85% ДНК знаходиться в складі нуклеосом. Між “бусинками” – нуклеосомами розташовуються ділянки з'єднуючої “нитки” –лінкерна ДНК, що містять 20 – 120 нуклеотидних пар. Посередині цієї ділянки розташована ще одна маленька “бусинка” - молекула гістону (Рис. 4.3.). Упаковочний коефіцієнт для нуклеосом становить 5-7.

Другий підрівень, супербідний, утворюється завдяки утворенню супервитків діаметром до 30-35 нм. Це своєрідний соленоїд, на один виток якого припадає 6-8 нуклеосом. Ця структура стабілізується за рахунок розташованого вздовж осі фібрили гістонового стрижня.

Третій підрівень, – це петлева структура. Соленоїдні структури випетлюються від білкового стрижня хромосоми. В результаті цього лінійні розміри ДНК зменшуються ще у 180 разів.. Таким чином, сама ДНК має біспіральну організацію і досягає висококомпактного стану суперспіралі при взаємодії з білками і утворюючи разом з ними хроматин, в якому на білок припадає близько 60 %, ДНК – 35 %, РНК – 5 % за масою.