Функциональная оценка т-лимфоцитов
Для лимфоцитов наиболее характерным ответом на встречу с митогенами и антигенами, к которым они специфичны, является пролиферация, связанная с активным синтезом в них ДНК. Пролиферативный ответ лимфоцитов на антигены и митогены является тестом, позволяющим оценить функциональную полноценность этих клеток.
Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ). Стимуляция лимфоцитов в реакции бласттрансформации основана на свойстве лимфоцитов в результате контакта с митогенами и антигенами превращаться в лимфобласты – клетки, готовящиеся к делению и активно синтезирующие ДНК.
При постановке РБТЛ применяются три группы стимуляторов:
1) аллогенные лимфоциты, то есть лимфоциты другого человека. Данная реакция используется, в основном, при подборе доноров для трансплантации;
2) антигенная стимуляция, когда используется антиген, сенсибилизация к которому должна быть определена;
3) Т-митогены, получаемые из растений (фитогемагглютинин, конканавалин А, митоген лаконоса), и В-митогены (декстран сульфат, бактериальные липополисахариды).
В клинико-иммунологических лабораториях используются, в основном, стимуляторы третьей группы, чаще всего – фитогемагглютинин (ФГА). Конечный результат в реакции бласттрансформации лимфоцитов оценивают двумя способами. Первый основан на морфологическом анализе, когда производится подсчет количества клеток, подвергшихся бласттрансформации, под микроскопом. Метод более прост, но трудоемок и дает значительный разброс результатов вследствие технических и субъективных ошибок.
В основе второго способа лежит радиометрическое измерение (рис. 55).
Рисунок 55. Реакция бластной трансформации лимфоцитов
Добавляя в культуру лимфоцитов меченный изотопом Н3-тимидин, необходимый для синтеза ДНК, с помощью жидкостного сцинтиляционного счетчика измеряют количество включенного клетками изотопа, причем одновременно проводят определение радиоактивности в параллельной культуре, в которую митоген не добавляли. Количество импульсов, регистрируемое автоматическим счетчиком, прямо пропорционально активности пролиферативного ответа лимфоцитов на стандартный митоген. Отношение величины включения Н3-тимидина в культурах без стимуляции к величине включения в стимулированных культурах отражает выраженность бласттрансформации. В норме индекс стимуляции для Т-лимфоцитов равен 10-20.
Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ). РТМЛ успешно применяют при изучении иммунного ответа при различных инфекционных заболеваниях, особенно обусловленных внутриклеточным паразитированием бактерий: туберкулез, бруцеллез, лепра; при кандидозах и хронических вирусных инфекциях; а также для установления сенсибилизации к аллергенам при аллергических заболеваниях (при изучении гиперчувствительности замедленного типа). Эту реакцию также применяют для определения степени гистосовместимости при трансплантации и оценки течения опухолевых процессов.
Принцип метода заключается в том, что лимфоциты иммунного донора при контакте со специфическим антигеном, к которому они сенсибилизированы, in vitro образуют и выделяют в культуральную среду факторы торможения миграции, угнетающие миграцию моноцитов/макрофагов. С помощью этой реакции можно в определенной степени оценить способность Т-лимфоцитов к синтезу цитокинов –медиаторов Т-клеточного иммунитета. У неиммунных доноров способность Т-лимфоцитов к синтезу факторов торможения миграции можно исследовать, используя вместо специфического антигена Т-митогены (ФГА, Кон-А).
Постановка метода. Смесь лейкоцитов, полученных из плазмы крови без примеси эритроцитов, смешивают в равных объемах (50 мкл) со средой 199 (в контроле) и с ФГА - индуцированный вариант. Концентрация ФГА составляет 10 мкг в 1 мл.
Существует несколько модификаций данной реакции. В планшет для иммунологических реакций, в дуплете или триплете, разливают среду 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей активированной сыворотки. Капилляры размером 7мм и диаметром 1 мм заполняют смесью лейкоцитов со средой или ФГА. Один конец запаивают смесью воска с парафином в соотношении 1:3, другой – опускают в ячейку планшета. Планшет закрывают крышкой, помещают на инкубацию при 37оC на 18-24 часа.
После удаления капилляров жидкость в лунках ресуспендируют. Подсчитывают с помощью камеры Горяева количество лейкоцитов в каждой лунке. Высчитывают среднее значение для контроля и для пробы с ФГА. Для вычисления индекса миграции концентрацию клеток в опыте делят на таковую в контроле. В норме соотношение равно 0,6-0,87.