17. Особенности замораживания культуры клеток и тканей животных.

Принципиально новые возможности электронной микроскопии открылись сравнительно недавно, после разработки метода "замораживания - скалывания". С помощью этого метода исследуются тончайшие детали строения клетки, при этом получается объемное изображение в трансмиссионном электронном микроскопе.

При обычном замораживании в клетках образуются кристаллики льда, которые заметно искажают их структуру. Во избежание этого клетки замораживают очень быстро при температуре жидкого азота (- 196╟ С). При таком мгновенном замораживании кристаллы льда не успевают образоваться, и клетка не испытывает деформаций.

Замороженный блок раскалывают лезвием ножа (отсюда и название метода). Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов. Однако весь фокус состоит в том, что напыление производится под углом к поверхности образца. Это очень важный момент. Появляется эффект тени, изображение выглядит объемным.

Один из недостатков метода хранения живых клеток в культурах тканей заключается в их дедифференциации, а также в изменении внешнего вида и присущих им свойств. Особенно это наблюдается при длительном культивировании, когда в течение ряда лет требуется неоднократно осуществлять пересевы. Использование глицерина и медленного охлаждения сделало возможным замораживание культивированных клеток чистых штаммов, включая фибробласты мыши, кролика и человека, и сохранение их жизнеспособности в течение многих месяцев и лет в условиях консервации при низких температурах. Таким путем удалось сохранить различные клетки злокачественных опухолей, в том числе клетки HeLa и клетки мышиной лимфосаркомы. Гаушка и сотрудники организовали банк замороженных тканей, в котором на протяжении 1—2 лет хранили 82 типа тканей (опухолевых и здоровых) в среде, содержащей 10—15% глицерина, при температуре —78°. Некоторые типы клеток и тканей были чувствительны к быстрому замораживанию, но зато переживали медленное охлаждение со скоростью 1° в 1 мин в пределах от 0 до —25°. В законсервированных таким путем клетках не наблюдалось никаких изменений; тем самым авторам удалось избежать дополнительных затрат времени и средств на сохранение клеток с помощью пересева культур.

18. Глубинное выращивание клеток животных в монослое.

 Глубинный способ предусматривает выращивание микроорганизмов нажидких средах. Этот способ применяют преимущественно при использовании в качестве продуцентов ферментов бактерий и других микроорганизмов,способных интенсивно развиваться в условиях недостаточного контакта клеток с кислородом. Он может быть применен и для культивирования аэробныхмикроорганизмов, какими являются плесневые грибы и некоторые бактерии, но для этого необходимо интенсивно аэрировать среду.     Другой способ получения слоя фидерных клеток — это инкубировать монослой клеток с митомицином С (10- М), что приводит к образованию поперечных сшивок в клеточной ДНК (Iyer, Szybalski, 1964). Монослой затем трижды промывают СБСР для удаления митомицина С, после чего его можно использовать либо непосредственно, либо после пересева клеток в культуральные сосуды меньшего размера. Для клонирования используются чашки Петри диаметром 6 см, содержащие 2-105 клеток, убитых либо уоблучением, либо обработкой митомицином С. Эти клетки образуют слой фидерных клеток. Среду в чашках с фидерными клеткамизаменяют суспензией клеток, предназначенных для клонирования. На такие чашки -МОЖНО высевать 10 клеток, но наилучшие результаты получаются при высеве 1000 клеток. Клонируемые клетки прикрепляются к субстрату в свободных участках между фидерными клетками и начинают размножаться, что приводит кобразованию колоний, которые можно выделить с помощью цилиндров для клонирования.