14. История метода получения культуры клеток животных. Особенности системы культивирования животных клеток.

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор^[1], содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней^[2]. Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. В 1910 г. Пейтон Раус, работая с культурой клеток саркомы цыпленка, индуцировал образование опухолей у здоровых животных. Позже это привело к открытию онкогенных вирусов (Нобелевская премия по физиологии или медицине 1966 г.).

Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa.

1. 1834 -1900 гг. - создание и разработка клеточной теории.

2. 1900 – 1922 гг. - сформулирована идея культуры тканей.

3. 1922 – 34 гг. - безуспешные поиски методов, обеспечивающих длительное культивирование тканей.

4. 1934 - 39 гг. - детальная разработка техники культуры растительных тканей.

Существует 2 основных системы культивирования клеток.  1. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.

Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами:

• прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды);

• постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются);

• перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды).  Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.

Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.

2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

15. Глубинное выращивание клеток животных в инкапсулированном состоянии.

Глубинное выращивание клеток животных в инкапсулированном состоянии В противоположительность суспензионным культурам клеток на микроносителях разрабатываются способы инкапсулирования их в полимерные среды (полилизиновые, агарозные, изоиолимерные слои). В этом случае клетки не испытывают большого механического напряжения, которые они должны использовать в свободном виде.

Микросферы для иммобилизации клеток млекопитающих из микропоСпособ инкапсулирования оказался выгодным для ристых, биологически инертных стекла (а) и стеклошлака (так назыкультивирования гибридом в целях получения монокловаемого Cultispher-G) (б) увеличение 10 нальных антител. Диаметр микрокапсул, размер пор в них и их толщина могут быть независимо проконтролированы в Рекомендуемый размер носителей - 200±25 мкм. Трепроцессе изготовления и оптимизирования для конкретного буемое количество их равно 104/мл, а для инокуляции необ19 типа гибридом. Для этого разработана спецтехнология. физического удаления полилизиновой мембраны можно исГибридомные клетки суспензируют и биосовместимом рас- пользовать ферментативный гидролиз.

творе натрия альгината. Образовывавшиеся капельки затем В описанные микросферы возможно инкапсулировать пропускают в раствор кальция хлорида (CaCl2), где они ста- не только клетки, но и ферменты, индукторы каких-либо новятся желированными микросферами. На поверхности процессов, а также мультисистем.

таких сред затем формируют полилизиновую мембрану. Таким образом, глубинное выращивание животных После этого гель разжижают, оставляя гибридомные клетки клеток реализуют в трех вариантах:

в нормальном физиологическом состоянии внутри «дырча- 1. монослой клеток статичен, культуральная фаза подтых» микросфер. При культивировании инкапсулированных вижна;

гибридом продукция моноклональных антител возрастает в 2. среда культивирования статична, монослой клеток тысячи раз по сравнению с обычным культивированием подвижен;

гибридомных клеток. После завершения биосинтеза антител 3. клетки (например, на микроносителе в микросфемикрокапсулы подвергают диализу для удаления примесей рах) и среда культивирования подвижна.

веществ, а затем физически из «раскрывают», гибридомные Эти варианты надо иметь в виду при выборе технолоклетки и фрагменты капсул легко сепарируются от искомых гии и проектировании оборудования.

моноклональных антител, которые могут быть подвергнуты В опытно-промышленных условиях получают интердополнительной очистке или использованию по назначению ферон, выращивая микробласты человека в виде отъемно(рис. 5). доливных культур, т.е. когда определенная часть клеточной суспензии замещается свежей средой, например, ultroser HY (Германия), а оставшаяся часть «старой» культуры выполняет роль инокулята.