Вопросы по дисциплине

«Технология культивирования клеток и тканей растений и животных»

Уровень 1

1. Культура клеток, органов и тканей растений. История развития метода культуры клеток растений

2. Дайте характеристику каллусной культуры

3. Тотипотентность растительной клетки

4. Какие ученые внесли вклад в развитие методов культуры клеток растений и животных

5 Особенности каллусных клеток

6. Гормоны роста и их роль при культивировании культуры клеток растений

7. Фазы ростового цикла в периодической суспензионной культуре

8. Культура протопластов

9. Виды соматических гибридов

10. Методы культивирования изолированных клеток и тканей

11. Гибридомная технология

12. Структура и функции антител

13. История создания метода получения моноклональных антител

14. Способы иммунизации животных

15. Режим стерилизации растительных эксплантов и питательных сред

16. Питательные среды, поддерживающие синтез продуктов вторичного метаболизма

17. Основные культивируемые элементы культур клеток животных

18. Типы культур клеток и тканей животных, и источники их получения.

19. Опишите первичные культуры клеток животных

20. Опишите постоянные культуры клеток животных

21. Характеристика проточных и непроточных культуральных систем

22. Ростовые факторы при культивировании культуры клеток животных и их назначение

23. Трипсин, версин

24. Биореактор для культур клеток

25. Эрлифтный ферментер

Уровень 2

1. Уровни организации живой материи

2. Клетки эукариот и прокариот

3. Культура клеток растений, ее характеристика

4. Каллус. Этапы развития каллусной культуры

5. Понятие «культура изолированных тканей», особенности их культивирования.

6. Состав питательных сред для культивирования культуры клеток растений

7. Состав питательных сред для культивирования клеток животных

8. Соматическая гибридизация

9. Способы выделения протопластов

10. Способы и условия культивирования протопластов

11. Этапы получения моноклональных антител

12. Предпосылки возникновения гибридом

13. Системы, входящие в структуру биореактора

14. Периодическая и непрерывная ферментация

15.Факторы, влияющие на рост и развитие растительной ткани in vitro.

16. Опишите стадии роста клеточной популяции при культивировании в накопительном режиме.

17. Витрификация, как метод хранения и транспортирования клеточной культуры животных.

18. Общая характеристика суспензионных культур клеток растений

19. Общая характеристика суспензионных культур клеток животных

20. Микроносители при монослойном культивировании клеток животных

21. Роль сыворотки при культивировании клеток животных

22. Бессывороточные питательные среды, их преимущества

23. Фазы роста культуры животных клеток

24. Оборудование, используемое при работе с клеточными культурами

25. Лабораторные ферментеры для культивирования клеточных культур

Уровень 3

1. Субклеточные макромолекулярные структуры

2. Клетки эукариот, их основные органоиды

3.Основы клеточной биотехнологии: геномика

4. Основы клеточной биотехнологии: протеомика

5. Основы клеточной биотехнологии: биоинформатика

6. Дайте описание физического и химического методов слияния протопластов

7. Механизм слияния протопластов

8. Факторы , влияющие на рост протопластов

9. Преимущества энзиматического способа слияния протопластов

10. Организация цитоскелета протопластов и соматических гибридов растений

11. Слияние клеток животных при получении гибридом

12. Назначение способа иммунизация животных клеток

13.

14. Устройства для приготовления питательных сред, условия и техника культивирования,

15. Опишите рост клеток в монослое

16. Процесс подготовки клеточного монослоя при культивировании

17. Опишите клеточный цикл и цикл роста животных клеток.

18. принцип составления питательных сред для культивирования клеток жтвотных

19. Приборы для разведения и пробоотбора с клеточными культурами животных

20. Устройства для приготовления питательных сред для культивирования клеток животных

21. Помещения для работы с культурой клеток животных

22. СО2 – инкубаторы их назначение и применение

23. Аэраторы, их назначение и применение в процессе культивирования культуры клеток животных

24. Лабораторные встряхиватель, роллерные установки

25. Конструкционные особенности лабораторных ферментеров

4 уровень

1. Применение изолированных протопластов

2. Введение микроорганизмов в изолированные протопласты

3. Цели создания исскуственных ассоциаций

4. Области применения моноклональных антител

5. Функциональная структура антител

6. Выбор и стерилизация растительного экспланта

7. Индукция, субкультивирование и поддержание каллуса.

8. Окрашивание ФДА для определения жизнеспособности протопластов

9. Метод электрослияния протопластов

10. Обработка образцов и предварительное фракционирование

11. Стадия разделения и очистка продуктов вторичного метаболизма

12. Модификация существующих биореакторов.

13. Крупномаштабное выращивание клеток животных

14. Способы культивирования проточных и непроточных культур

15. Требования к поверхности субстрата при монослойном культивировании клеток животных

16. Преимущества и недостатки культур клеток при монослойном культивировании

17. Период экспотенциального роста культур клеток животных

18. Факторы при выборе ткани или линии клеток животных

19. Стерилизация питательных сред для культивирования клеток животных методом фильтрования.

20. Процесс трипсинизации при культивировании клеток животных

Уровень 5

1. Культура клеток в решении теоретических проблем биотехнологии

2. Культура клеток в производстве биологически активных соединений

3. Культура клеток в модификации различных классов органических веществ

4. Культура клеток и ее использование в различных научных и практических областях

5. Культура клеток растений как объект биотехнологии и перспективы ее использования.

6. Механизм проникновения микроорганизмов в протопласты

7. Методы анализа на основе моноклональных антител

8. Генетическая конструкция генома соматических гибридов

9. Как влияет процесс перемешивания на доставку кислорода из культуральной среды к клеткам

10. Каковы относительные преимущества и недостатки биореакторов с механическим перемешиванием и эрлифтных биореакторов

Все биореакторы можно отнести к одному из трех основных типов реакторы смеханическим перемешиванием, барботажные колонны, эрлифтные реакторы. В настояшее время в промышленности чаще всего используются биореакторы первого типа, но появляется интерес и к эрлифтным биореакторам.Механическое перемешивание обеспечивается с помощью механической мешалки, а в эрлифтных биореакторах для аэрации и перемешивания используют газ (обычно воздух), который подается под давлением через разбрызгиватель в дне сосуда. При этом во всем объеме происходит непрерывная циркуляция жидкой среды. Барботажные колонны сходны с эрлифтными реакторами, но их недостатком является отсутствие циркуляции культуральной среды. Для обеспечения стерильности, постоянства pH, температуры и других параметровиспользуют разные способы в зависимости от дизайна биореактора. Для синтезарекомбинантных белков применяют двухступенчатые процессы ферментации, осуществляемые в тандемных эрлифтных биореакторах или в одном реакторе с механическим перемешиванием. 

 Между отдельными элементами БТС имеется функциональная взаимосвязь.Элементы взаимодействуют между собой и с окружающей средой в виде материального, энергетического и информационного обмена. На уровне элементовБТС реализуются типовые процессы преобразования вещества и энергии, например, механические в смесителях, биохимические в биореакторах, тепловые в теплообменниках, стерилизаторах и т. д. В соответствии со стратегией системногоанализа на уровне отдельных элементов схемы ставится задача полученияфункционального оператора или модуля, представляющего собойматематическую модель типового технологического процесса. В зависимости от функциональной сложности технологического элемента для его описания могут быть использованы один или несколько типовых операторов.

Биореакторы с механическим перемешиванием среды [c.137]     Определенные требования на выбор варианта аппаратурного оформления процесса культивирования микроорганизмов накладывает величина объема выпуска продукции. При создании крупно-тоннажных биореакторов большого объема (до 1000 м и более) могут оказаться неприемлемыми технические решения, эффективные для небольших по объему аппаратов. Так, трудности в разработке мощных приводов для механических перемешивающих устройств обусловливают переход к промышленным биореакторам с распределенным вводом энергии с использованием нескольких приводов, что в свою очередь затрудняет решение вопросов стерильности, механической надежности и т. д. Характерной особенностью конструкций биореакторов является выбранный принципперемешивания среды, определяющий способ ввода энергии, а в ряде случаев иэффективность массообменных процессов в аппарате. 

В реакторах с механическим перемещиванием газ (как правило, воздух) подают вкультуральную среду под давлением через разбрызгиватель — кольцо с множеством маленьких отверстий либо трубку с одним отверстием. В первом случае образуются мелкие пузырьки воздуха и обеспечивается их более равномерное распределение, однако разбрызгиватели в виде трубок используются чаще, поскольку они реже закупориваются. Для равномерного распределения газа по всему объему биореактора используются мешалки — одна или несколько. Они разбивают крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору и увеличиваютвремя пребывания в культуральной среде. При сильном перемешивании средний размер пузырьков в больших биореакторах практически не зависит от размераотверстий в разбрызгивателе. Эффективность распределения газа зависит прежде всего от типа мешалки, числа оборотов и физико-химических свойств среды. Если размер биореактора слишком велик, а газ, поступающий из разбрызгивателя, распределяется по объему неравномерно, то даже при энергичном перемешивании гомогенизировать среду не удается. 

  В реакторах с механическим перемещиванием газ (как правило, воздух) подают вкультуральную среду под давлением через разбрызгиватель — кольцо с множеством маленьких отверстий либо трубку с одним отверстием. В первом случае образуются мелкие пузырьки воздуха и обеспечивается их более равномерное распределение, однако разбрызгиватели в виде трубок используются чаще, поскольку они реже закупориваются. Для равномерного распределения газа по всему объему биореактора используются мешалки — одна или несколько. Они разбивают крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору и увеличиваютвремя пребывания в культуральной среде. При сильном перемешивании средний размер пузырьков в больших биореакторах практически не зависит от размераотверстий в разбрызгивателе. Эффективность распределения газа зависит прежде всего от типа мешалки, числа оборотов и физико-химических свойств среды. Если размер биореактора слишком велик, а газ, поступающий из разбрызгивателя, распределяется по объему неравномерно, то даже при энергичном перемешивании гомогенизировать среду не удается.

11. Какой термической обработке подвергают клеточную суспензию по завершению процесса ферментации

Теплообменные процессы в биохимическом производстве протекают практически на всех технологических стадиях. На стадии приготовления питательной среды в теплообменных аппаратах осуществляют тепловую стерилизацию солевых потоков воды, повторно используемой культуральной жидкости. Выносные и встроенные теплообменники используются на стадии ферментации для снятия биологического тепла. Тепловая обработка суспензий микроорганизмов используется для улучшения условий концентрирования клеток.

После завершения процесса ферментации бактериальные клетки отделяют от культуральной среды центрифугированием и ресуспендируют в соответствующем буферном растворе, после чего разрушают с помощью ультразвуковой обработки или другими известным способом. Разрушенные клетки подвергают центрифугированию и используют водорастворимую фракцию для последующего выделения целевого продукта. Для этого проводят подкисление водорастворимой клеточной фракции до рН 4,0 и две стадии гидрофобной хроматографии на фенильных сорбентах, фенил-Сефарозе CL4В и фенил-Суперозе-12. Уже на первой стадии при подкислении водорастворимой фракции разрушенных клеток до рН 4,0 95% IL-1beta оставалось в супернатанте, тогда как большинство бактериальных белков и нуклеиновых кислот удалялось при центрифугировании. Данная процедура при высоком выходе целевого белка позволяла обеспечить его 80%-ную чистоту. Две последующие хроматографии на гидрофобных сорбентах сначала при нейтральных, а затем кислых значениях рН позволили получить электрофоретически чистый препарат с удельной активностью около 2х108МЕ/мг, что хорошо коррелировало с известными данными, полученными для выделенного из природных источников hIL-1beta (Tocci et al. 1987). Чистота препаратов hIL-1beta в процессе выделения анализировалась с помощью SDS-PAGE (фиг.2). Выделенный белок элюировался в виде гомогенного пика при HPLC-хроматографии на колонке Pro RPC ("Pharmacia") при рН 2,0 в градиенте ацетонитрила. Использованный метод выделения обеспечивал 60%-ный выход целевого белка, что составляло 5-10 мг интерлейкина-1 бета из 1 г влажной биомассы. Определение N-концевой последовательности полученного белка проводили методом Эдмана на автоматическом сиквенаторе "Beckman-890". Определение биологической активности рекомбинантного интерлейкина-1 бета проводилось по его комитогенному действию на пролиферацию мышиных тимоцитов в стандартном тесте (Mizel and Mizel, 1981; Rosenwasser et al. 1986) с некоторыми модификациями, как описано ранее (Котенко и др. 1989). За одну единицу биологической активности интерлейкина-1 бета принималась доза препарата, обеспечивающая 50% от максимальной пролиферации мышиных тимоцитов в стандартных тест-системах, как подробно описано в лабораторных протоколах (Mizel, 1979). Изобретение иллюстрируется фиг.1-3. На фиг. 1 показана физико-генетическая карта рекомбинантной плазмиды pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr. Рекомбинантная плазмида сконструирована с использованием следующих фрагментов ДНК: (1) TaqI-BglII-фрагмент, несущий ген cIts857 фага лямбда, pR и pRM промоторы и 20 N-кoнцевых кодонов гена cro, cro', (от 37165 до 38100 н.п. ДНК фага лямбда; Sanger et al. 1982); (2) кодирующий участок гена cat из pBR325 (775 н.п. фрагмент TaqI; Bolivar, 1978), фланкированный двумя сайтами BamHI, аналогично соответствующему гену в плазмиде рСМ4 (Close и Rodriguez; 1982); (3) фрагмент BamHI-SalI плазмиды pPR-TGATG-1 (прибл. 420 н.п.) (Mashko et al. 1990); SalI-KpnI фрагмент ДНК, несущий HindII фрагмент плазмиды pSC101 (4521-7449 н.п. на кольцевой карте pSC101; Bernardi и Bernardi, 1984), содержащий ori- и par участки (данный фрагмент ДНК был предварительно интегрирован в SmaI-сайт, расположенный в составе полилинкера плазмиды pUC18 (Yanish-Perron et al. 1985); (4) ClaI-SalI фpагмент (прибл. 2100 н.п.) плазмиды pPR-TGATG-1 (Mashko et al. 1990), несущий ген устойчивости к ампициллину и генетический локус ColE1-подобной плазмиды, обеспечивающий репликацию ДНК, в котором промотор праймерной РНК (PHKII, Davison, 1984) (3087-3205 н.п. на кольцевой карте плазмиды pBR322, Sutcliffe, 1979) заменен на фрагмент ДНК, содержащий pL-промотор фага лямбда и локус nutL (положение 35,653-32,513 в ДНК фага лямбда, (Sanger et al. 1982), а также фланкирующий этот фрагмент ДНК SalI сайт заменен на сайт KpnI с помощью соответствующего линкера. На фиг. 2 показаны электрофореграммы клеточных белков в 0,1% SDS 12,5% ПААГ, получаемых в ходе очистки hIL-1beta из клеток E.coli С600 [pPR-TGATG-hIL-1beta-tsr] Образцы кипятили 15 мин в буфере для нанесения образцов (60 мМ Трис-HCl рН 6,8) (2,3% SDS) 10% глицерин (5% 2-меркаптоэтанол) и полученные надосадочные жидкости анализировали согласно Laemmli (1970). Полосы белка проявляли путем прокрашивания в Кумасси синем. 1. Белковые маркеры (набор маркеров для белкового электрофореза, Pharmacia) с мол.весами 94, 67, 43, 30, 20,1 и 14,4 кДа; 2. Суммарные белки клеток продуцента после термоиндукции в течение 2 ч; 3. Надосадочная жидкость, содержащая водорастворимые клеточные белки, подкисленная до рН 4,0; рекомбинантный hlL-1beta, полученный после двух стадий хроматографической очистки на фенильных сорбентах.