Itogavya / Ответы к итоговой МБ №4 ООИ (КубГМУ Live)

103. Морфологические и тинкториальные свойства дифтерийной палочки.

Тинкториальные и морфологические свойства.

С. diphtheriae — тонкие, слегка изогнутые или прямые грамположительные палочки размером от 1-6 х 0,3-0,8 мкм. Они утолщены на концах за счет наличия зерен волютина (зерен Бабеша—Эрнста) на одном или обоих полюсах клетки, что придает им вид булавы или булавки.

Благодаря зернам волютина, состоящим из полифосфатов, для С. diphtheriae характерно неравномерное окрашивание клеток, так как зерна волютина воспринимают любой анилиновый краситель более интенсивно, чем цитоплазма клетки, и вследствие присущей им метахромазии приобретают не обычный цвет. Зерна волютина легко выявляются при окраске препаратов метиленовым синим по Леффлеру, а также при окраске по Нейссеру в виде гранул темно-синего или си- не-черного цвета соответственно. Они резко контрастируют с бледно-синим или светлокоричневым фоном микробной клетки. При окраске по Граму зерна волютина выявить не удается.

При люминесцентной микроскопии окрашиваются корифосфином в оранжево красный цвет, в то время как тела бактерий - в желто-зеленый цвет. Дифтерийная палочка не обладает кислотоустойчивостью, неподвижна, спор и капсул не образует; имеет микрокапсулу с входящим в ее состав корд-фактором. Клеточная стенка у С. diphtheriae имеет сложное строение. Она содержит вещества пептидополисахаридной природы, в состав которых входят галактоза, манноза, арабиноза. Как и микобактерии, С. diphtheriae содержат в составе клеточной стенки большое количество липидов, в том числе некислотоустойчивые коринеформные миколовые кислоты. Для С. diphtheriae характерен полиморфизм размеров и формы. Благодаря разламывающему механизму деления, клетки не расходятся и располагаются в мазках под углом, напоминая латинские буквы L, X, V, Y или растопыренные пальцы рук, за что их называют «булавовидными двукрылками».

Наличие поверхностных липидрв способствует образованию скоплений плотно прилегающих в результате спонтанной агглютинации пало чек, напоминающих «свалявшуюся шерсть в войлоке» или «пакет булавок». В культуре одного и того же штамма наряду с типичными длинными, изогнутыми и изящными палочками можно обнаружить короткие, толстые, с вздутиями на одном или обоих концах клетки, а также карликовые, гигантские или ветвящиеся нитевидные клетки. Полиморфизм чаще выявляют при культивировании на искусственных питательных средах, содержащих большое количество сывороточных белков, что способствует несбалансированному росту бактерий. Данные микроорганизмы образуют также фильтрующиеся и L-формы бактерий. Полиморфизм С. diphtheriae, их взаиморасположение, наличие зерен волютина по полюсам имеют дифференциально-диагностическое значение при

51

проведении идентификации. Коринеформные бактерии, обитающие на коже и слизистых оболочках, располагаются в микропрепаратах в виде равномерно го частокола; зерен волютина не имеют или содержат их в большом количестве.

104. Культуральные и биохимические свойства дифтерийной палочки.

Культуральные и биохимические свойства. Неоднородность С. diphtheriae находит свое отражение в культуральных и биохимических свойствах. Возбудитель дифтерии относится к факультативным анаэробам, культивируется при 37 °С, оптимум pH — 7,4-8,0. Гетеротроф. В отличие от коринеформных бактерий, С. diphtheriae на простых питательных средах не растет, так как не продуцирует эндопротеазы, способные расщеплять нативные белки до аминокислот; аминокислоты усваиваются ими только из продуктов гидролиза белков — пептонов.

Оптимальные среды для культивирования С. diphtheriae должны содержать аминокислоты, органические источники энергии, источники Mg2+, Cu2+, Са2+, витамины, кровь или сыворотку. Питательная ценность последних обусловлена наличием в них факторов роста (правовращающая молочная кислота, никотиновая и пимелиновая кислоты), а ненативных белков, которые данный микроб не расщепляет. К стимуляторам роста относится также олеиновая кислота.

Для выделения С. diphtheriae из патологического материала применяется свернутая кровяная сыворотка как таковая (элективная среда Ру) или с добавлением сахарного бульона (элективная среда Ру—Леффлера), а также кровяной агар, кровяной теллуритовый агар (среда Клауберга II), хинозольная среда Бучина, цистин-теллурит- сывороточная среда Тинсдаля—Садыковой. На элективных средах возбудитель дифтерии опережает в росте банальную микрофлору и через 8-14 ч вырастает в виде изолированных точечных, выпуклых желтовато-кремовых колоний с гладкой или слегка зернистой поверхностью. Колонии не сливаются, вследствие чего они имеют вид шагреневой кожи. На теллуритовых средах С. diphtheriae растут медленно (в течение 2448 ч) в виде черных или черно серых колоний в результате восстановления теллурита до металлического теллура, который накапливается внутри бактерий в виде кристаллов. Возбудитель дифтерии устойчив к высоким концентрациям теллурита калия или натрия, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры. На среде Бучина через 24-48 ч на месте роста колоний С. diphtheriae среда приобретает фиолетовый цвет, а колонии окрашиваются в синий цвет. На среде Тинсдаля—Садыковой С. diphtheriae образуют серые или темно-коричневые колонии, окруженные темно-коричневым ореолом, который специфичен для возбудителя дифтерии.

В отличие от коринеформных бактерий, возбудитель дифтерии, относясь к факультативным анаэробам, растет в глубине столбика сахарного агара. Коринеформные бактерии образуют поверхностный налет, так как являются облигатными аэробами.

52

105. Факторы патогенности дифтерийной палочки.

Основными факторами патогенности возбудителей дифтерии являются поверхностные структуры липидной и белковой природы, к которым относится корд-фактор, вместе с К-антигенами и коринеформными некислотоустойчивыми миколовыми кислотами входящий в состав микрокап сулы, ферменты и токсины. Поверхностные структуры способствуют адгезии микробов в месте входных ворот инфекции, препятствуют фагоцитозу бактерий, оказывают токсическое воздействие на клетки макроорганизма, разрушают митохондрии.

С. diphtheriae образуют ферменты агрессии и инвазии; нейраминидазу и N - ацетилнейрамиатлиазу, гиалуронидазу, а также гемо лизин и дермонекротоксин. Нейрамииидаза и N-ацетилнейрамиатлиаза действуют на эстафетной основе, обеспечивая бактерии энергетическим сырьем. Нейрамииидаза отщепляет N- ацетилнейраминовую кислоту от гликопротеинов слизи и поверхности клеток, а лиаза расщепляет ее на пируват и N -ацетилманнозамин. Пируват служит готовым источником энергии, стимулируя рост С. diphtheriae. Одним из последствий действия гиалуронидазы является повышение проницаемости кровеносных сосудов и выход плазмы за их пределы, что ведет к отеку окружающих тканей. Некротоксин вызывает некроз клеток в месте/локализации возбудителя. Вышедший за пределы сосудов фибриноген плазмы, кон тактируя с тромбокиназой некротизированных клеток макроорганизма, превращается в фибрин, что и является сущностью дифтеритического воспаления. Находясь внутри дифтеритической пленки С. diphtheriae на ходят отличную защиту от действия эффекторов иммунной системы макроорганизма и антибиотиков. Размножаясь, они образуют в большом количестве основной фактор патогенности —

дифтерийный гистотоксин.

106. Дифтерийный токсин, активация, структура, механизм действия.

Дифтерийный гистотоксин синтезируется в виде единой полипептидной цепи (протоксина), А- и В-фрагменты которой в интактной моле куле соединены дисульфидными мостиками.

Протоксин активируется под действием протеолитических ферментов и тиоловых соединений, что ведет к образованию бифункциональ ной А—В-структуры токсина.

Ограниченный протеолиз происходит под действием протеаз как самого микроба, так и сопутствующей микрофлоры, либо под действием протеаз макроорганизма. Восстановление дисульфидных групп в сульфгидрильные ведет к завершению фрагментирования цепи, но расхождение образо вавшихся фрагментов А и В происходит только после контакта с рецепторами чувствительной клетки.

53

Таким образом, рецепторы связывают дифтерийный гистотоксин исключительно в интактном состоянии его молекулы.

Фрагмент В отвечает за взаимодействие со специфическими ганглиозидными рецепторами клетки и участвует в образовании транспортного канала для фрагмента А.

Активированный фрагмент А отвечает за токсичность. Попав в цитозоль эукариотической клетки, он становится недосягаемым для действия антитоксических антител, которые через мембрану клетки не проникают. Внутри пораженных клеток фрагмент А обладает ферментативной активностью. Он относится к АДФ-рибозил-трансферазам и вызывает АДФ-рибозилирование фактора элонгации EF-2 (трансферазы 2), необходимого для построения пептидных цепей на рибосомах эукариотической клетки. Блокада функциональной активности фермента ведет к нарушению синтеза белка на стадии элонгации и гибели клеток в результате некроза. Прокариотические клетки нечувствительны к действию дифтерийного гистотоксина, так как используют другой фактор элонгации (EF-6).

Дифтерийный гистотоксин оказывает свое специфическое блокирующее воздействие на синтез белка в органах, наиболее интенсивно снабженных кровью: сердечно сосудистая система, миокард, периферическая и ЦНС, почки и надпочечники.

107. Генетический контроль синтеза дифтерийного токсина.

Генетические структуры, управляющие синтезом дифтерийного токсина, функционируют независимо от всех органоидов, обеспечивающих жизнедеятельность микробов. В связи с этим коринебактерии могут терять ген tox, и, собственно, патогенные свойства.

В лабораторных условиях доказана возможность конверсии нетоксигенных штаммов коринебактерии в токсигенные с помощью бактериофага, содержащего геном токсигенности. Этот феномен получил название лизогенной конверсии. Лизогенные штаммы возбудителей обладают теми же свойствами, что и циркулирующие в коллективах возбудители заболевания.

108. Эпидемиология дифтерии.

Дифтерия относится к антропонозным заболеваниям. В естественных условиях ею болеет только человек, не обладающий устойчивостью к возбудителю и антитоксическим иммунитетом (содержание в крови антитоксина по методу Иенсена < 0,03 АЕ/мл). Заболевание имеет повсеместное распространение. Для заболеваемости дифтерией характерна сезонность. Наибольшее количество больных наблюдается во второй половине сентября, в октябре и ноябре. Наиболее восприимчивы к данному

54

заболеванию дети ясельного и школьного возраста. Среди взрослых к профессиональной группе повышенно го риска относятся работники общественного питания и торговли, школ, детских дошкольных и медицинских учреждений.

АЕ – это такое минимальное количество сыворотки, которое нейтрализует 100 DLF дифтерийного токсина.

Источником инфекции при дифтерии являются больные и носители токсигенных штаммов С. diphtheriae. Больной эпидемиологически опасен в течение всего периода заболевания, так как даже в период выздоровления он может выделять токсигенные штаммы бактерий в окружающую среду. Среди больных наибольшее эпидемическое значение имеют лица с локализацией процесса в верхних дыхательных путях, поскольку они наиболее интенсивно выделяют микробов в окружающую среду. Большая часть заболеваний возникает в результате заражения от носителей токсигенных штаммов. У этих лиц нет клинических проявлений заболевания, потому что они обладают антитоксическим иммунитетом.

Механизм заражения и пути передачи. В соответствии с основной локализацией возбудителя в верхних дыхательных путях, аэрозольный механизм заражения является основным. Ведущая роль принадлежит воздушно-капельному пути передачи инфекции, при котором микробы выделяются в окружающую среду больным или носителем токсигенных штаммов С. diphtheriae при разговоре, кашле или чихании. Вместе с вдыхаемым воз духом взвешенные в нем частицы попадают на слизистые оболочки ротоглотки, а также верхних дыхательных путей человека, вызывая заражение. Благодаря устойчивости возбудителя в окружающей среде, определенное значение в передаче инфекции имеют воздушно-пылевой и контактно-бытовой пути передачи. Последний путь передачи определяет спорадическое возникнове ние редких форм дифтерии с экстрафарингеальной локализацией, когда возбудитель передается инфицированными через предметы общего пользования (полотенца, игрушки, носовые платки) руками. Попадание возбудителя в молоко, где он активно размножается, обуславливает алиментарный путь передачи инфекции. При дифтерии кожи и ран имеют место контактный и трансмиссивный (чаше в тропиках) пути передачи.

109. Патогенез дифтерии.

Патогенез и клинические проявления заболевания. Входными воротами инфекции служат слизистые оболочки ротоглотки (небные миндалины и окружающие их ткани), носа, гортани, трахеи, а также слизистые оболочки глаз и половых органов, поврежденные кожные покровы, раневая или ожоговая поверхность, опрелости, незажившая пупочная ранка.

55

Наиболее часто встречается дифтерия ротоглотки (90-95 %), чему способствуют воздушно-капельный путь передачи, тропизм микробов к слизистой оболочке и барьерная функция лимфоидного глоточного кольца.

Инкубационный период при дифтерии — от 2 до 10 дней. Начало заболевания в легких случаях постепенное, в тяжелых — острое. Температура повышается до 38-40 °С. По патогенезу дифтерия относится к токсинемическим инфекциям, при которых микроб остается в месте входных ворот инфекции, а все основные клинические проявления заболевания связаны с действием белкового бактериального токсина. Это имеет значение для диагностики, лечения и профилактики заболевания.

Начальным этапом инфекционного процесса является адгезия микроба в месте входных ворот инфекции за счет поверхностных структур бактериальной клетки (корд-факгор и коринеформные миколовые кислоты) и их колонизация. Размножаясь в месте входных ворот инфекции, С. diphtheriae образует дифтерийный гистотоксин, который оказывает местное воздействие на клетки тканей, а также поступает в кровь, что ведет к возникновению токсинемии. При наличии антитоксического иммунитета процесс может ограничиться легкой формой заболевания или формированием бактерионосительства.

В области входных ворот инфекции развивается воспалительная реакция, сопровождающаяся некрозом эпителиальных клеток, отеком и выходом фибриногена из сосудистого русла в окружающие ткани, превращением его в фибрин под действием тромбокиназы, освободившейся при некрозе эпителиальных клеток. Это ведет к образованию налетов белого цвета с сероватым или желтоватым оттенком, содержащих большое количество микробов, продуцирующих токсин. Фибринозная пленка — характерный признак дифтерии. Фибринозное воспаление при дифтерии может быть

дифтерическим или крупозным.

110. Микробиологическая диагностика дифтерии.

Основным является бактериологический метод диагностики. Цель данного метода заключается в выделении чистой культуры С diphtheriae и идентификации их на основании морфологических, культуральных, биохимических и токсигенных свойств. При наличии клинических симптомов заболевания выделение токсигенных штаммов

С. diphtheriae является абсолютным подтверждением диагноза дифтерии, а при их отсутствии свидетельствует о бактерионосительстве.

Материалом для исследования служат слизь и пленки из очагов воспаления, а также секрет из очагов патологического процесса. Сбор материала необходимо проводить в течение 3-4 ч (не позже 12 ч) с момента обращения больного, Для взятия материала используют ватные тампоны, если посев будет проведен не позднее 2—3 ч после сбора материала. При транспортировке материала на дальние рас стояния можно

56

использовать тампоны, пред варительно смоченные 5% раствором глицерина. При исследовании на дифтерию во всех случаях, в том числе и при экстрафарингеальной локализации, материал для исследования берут раздельными тампонами одно временно из зева и носа, а при необходимости — из других мест локализации воспаления. Посев делают раздельно на поверхность одной из рекомендованных инструкцией сред.

Бактериологическая лаборатория через 48 ч выдает ответ об отсутствии в анализах С. diphtheriae или, в случае наличия положительных результатов исследования на токсигенность (не более 6 колоний) и пробы на цистиназу, о выделении токсигенных штаммов С. diphtheriae. Экспресс-метод бактериологической диагностики — посев материала на жидкие питательные среды с последующей постанов кой ИФА — позволяет определить токсинные штаммы за 18 часов.

Различают 3 вида показаний к проведению бактериологических исследований на дифтерию:

1)диагностическое обследование детей и взрослых с острыми воспалительными явлениями в носоглотке, особенно при подозрении на дифтерию;

2)по эпидемическим показаниям обследуют детей и взрослых, бывших в контакте с источником инфекции; 3)с профилактической целью обследуют лиц, вновь поступающих в детские дома, школы-

интернаты, специальные учреждения. Ввиду полиморфизма возбудителя (от мелких до крупных, сегментированных и бочкообразных форм), бактериоскопический метод диагностики дифтерии как самостоятельный диагностический метод не применяется, но может быть проведен по просьбе врача.

111. Методы определения токсигенности дифтерийной палочки.

Для обнаружения токсигенности дифтерийных бактерий можно использовать следующие способы:

1.Биологические пробы на животных. Внутрикожное заражение морских свинок фильтратом бульонной культуры дифтерийных бактерий вызывает у них некроз в месте введения.

2.Заражение куриных эмбрионов. Дифтерийный токсин вызывает их гибель.

3.Заражение культур клеток. Дифтерийный токсин вызывает отчетливый цитопатический эффект.

4.Метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием меченных пероксидазой антитоксинов.

5.Использование ДНК-зонда для непосредственного обнаружения Юх-оперона в хромосоме дифтерийных бактерий.

57

Однако наиболее простым и распространенным способом определения токсигенности дифтерийных бактерий является серологический – метод преципитации в геле. Суть его состоит в следующем. Полоску стерильной фильтровальной бумаги размером 1,5 х 8 см смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 500 АЕ в 1 мл, и наносят на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 15—20 мин. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от бумажки. На одну чашку засевают несколько штаммов, один из которых, заведомо токсигенный, служит контролем. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С, результаты учитывают через 24—48 ч. Вследствие встречной диффузии в геле антитоксина и токсина в месте их взаимодействия образуется четкая линия преципитации, которая сливается с линией преципитации контрольного токсигенного штамма. Полоски неспецифической преципитации (они образуются, если в сыворотке кроме антитоксина присутствуют в небольшом количестве другие антимикробные антитела) появляются поздно, выражены слабо и никогда не сливаются с полоской преципитации контрольного штамма.

112. Специфическая профилактика и лечение дифтерии, препараты.

Препараты для специфического лечения и профилактики дифтерии.

Дифтерия — это токсинемическая инфекция. Поэтому, исходя из патогенеза заболевания, в целях нейтрализа ции дифтерийного гистотоксина на первый план в лечении выходит применение специфической противодифтерийной лошадиной очищенной концентрированной жидкой сыворотки.

Препарат получают путем гиперим мунизации лошадей дифтерийным анатокси ном. Действующим началом препарата является дифтерийный антитоксин. Специфическое лечение противодифтерийной сывороткой начинают немедленно при клиническом подозрении на дифтерию.

В целях профилактики развития анафилакти ческого шока препарат вводят дробно по А. М. Безредке. Введение сыворотки после 3-го дня болезни считается поздним. Разработан также иммуноглобулин человека противодифтерийный для внутривенного введения. Поскольку введение антитоксина не оказывает влияния на размножение

С. diphtheriae в месте входных ворот инфекции, одновременно с введением антитоксической противодифтерийной сыворотки, больным необ ходимо обязательно назначать антибиоти ки, оказывающие действие на эти бактерии. Препаратами выбора являются пенициллин или эритромицин, либо другие β-лактамы и макролиды. При лечении бактерионосителей необходимо проводить стимуляцию антибак териального иммунитета.

Специфическая профилактика дифтерии для создания искусственного активного антитокси ческого иммунитета осуществляется дифтерийным анатоксином. Очищенный и концентриро ванный препарат входит в состав ассоциированных вакцин:

58

адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины (АКДС-вакцина), адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС-анатоксин), адсорбирован ного дифтерийно-столбнячного анатоксина с уменьшенным содержанием антигенов (АДС- М-анатоксин), адсорбированного дифтерийно го анатоксина с уменьшенным содержанием антигена (АД-М-анатоксин). Базисный иммунитет создается удетей соглас но календарю прививок полноценными в антигенном отношении препаратами. Препараты с уменьшенным содержанием антигена менее реактогенны и применяются только у детей старше 6 лет, подростков и взросльгх. Дифтерия относится к контролируемым инфекциям, но только 95%-й охват населения прививками гарантирует эффективность вакцинации.

Если у привитых лиц и возникает заболевание, то, как правило, протекает легко. В любом очаге дифтерии необходимо проводить экстренный иммунологический контроль состояния иммунитета, и выявленные, восприимчивые к этой инфекции лица должны быть незамедлительно привиты (защитный титр в РНГА 1:40 и выше).

В России зарегистрированы также следующие вакцины:

•тетракок, предназначенная для профилактики коклюша, дифтерии, столбняка и по лиомиелита (Пастер—Мерье, Франция). Она более реактогенная, чем АКДС;

•Д. Т. Вакс, содержащая дифтерийный и столбнячный анатоксины. Применяется у детей до 6 лет;

•ДТ-адюльт, содержащая дифтерийный и столбнячный анатоксины (Пастер-Мерье, Франция). Применяется у подростков и взрослых.

В настоящее время в России разработа ны и предложены новые вакцины для одно временной иммунизации против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В: АКДС-В- гепатитная вакцина («Бубо-Кок») и АДС4 В-гепатитная вакцина («Бубо-М»). «Бубо-М» состоит из поверхностного антигена виру гепатита В (HbsAg), полученного с помощью рекомбинантной технологии из культуры дрожжевых клеток, а также очищенных адсорбированных на гидроксиде дифтерийного и столбнячного анатоксинов уменьшенной концентрации, аналогичной] концентрации в АДС-М.

КОКЛЮШ

Возбудители коклюша - Вortedella pertussis

Коклюш — это острые антропонозные инфекционные заболевания человека, которые характеризуются поражением верхних дыхательных путей и приступами спазматического кашля.

59