7 Качественное и количественное определение белка
Присутствие белков в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы:
а) цветные реакции. Среди первой группы различают универсальные реакции (биуретовая на пептидные связи и нингидриновая на α-аминокислоты) и специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определенных аминокислот.
б) реакции осаждения. Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке.
Методы выделения и очистки белков. Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии.
Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода "азотной бомбы". В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается и клетки разрушаются.
Условия экстрагирования белков (время, гидромодуль, температура и т.д.) подбираются эмпирически, основываясь на методиках ведущих научных школ.
Большинство белков животных тканей хорошо растворимы в 5–10% растворах солей
При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.
Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония.
В практике выделения и очистки белков используются:
-Адсорбционная хроматография основана на различиях в полярности белков.
-В распределительной хроматографии в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются подлине колонки или бумаге.
-Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул
-Хроматография по сродству (аффинная хроматография,) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю.
-Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных).
-Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (–), передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью.
-Метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения.
-Метод пептидных карт и ультрацентрифугирование. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном – распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и определяют аминокислотный состав. В методе ультрафильтрации белки в градиенте плотности распределяются на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации (осаждения) в виде отдельных зон.
Очистка белков от низкомолекулярных соединений (солей, сахаров, аминокислот) осуществляется методами диализа, гель-фильтрации на сефадексе G-25, кристаллизации, ультрафильтрации и с помощью полых волокон.
Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля.
Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе "Техникон". Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N2).
В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе "Техникон" осуществляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, с щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.
Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.