Выделение свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов

Свободноживущие азотфиксирующие организмы распространены повсеместно и встречаются среди бактерий самых разных таксономических групп, относящихся как к хемотрофам, так и фототрофам к аэробам и анаэробам.

Наиболее хорошо изученным среди свободноживущих аэробных азотфиксирующих бактерий являются бактерии рода Azotobacter.

Azotobacter chroococcum – это соединенные в пары одиночные кокковидные клетки размером 3-7 мкм, в старой культуре клетки обычно окружены слизистой капсулой, а колонии темнеют до темно-серого и темно-коричневого цвета. Активность азотфиксации составляет до 20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества.

Наиболее изученными анаэробными свободноживующими азотфиксирующими организмами являются маслянокислые бактерии Clostridium pasteurianum, активность азотфиксации которых достигает до 12 мг азота на 1 г потребленного органического вещества.

Для выделения азотфиксирующих организмов из природных сред используют метод получения накопительных культур на синтетических средах, в которых отсутствуют источники азота. В частности используется среда Эшби, г/л: манит (или глюкоза, или сахароза) – 20; KH₂PO₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,2; NaCl – 0,2; K₂SO₄ – 0,1; CaCO₃ -5,0; рН среды 6,0-6,5.

Питательную среду по 30 мл, не стерилизуя, разливают в колбы объемом 100-150 мл и вносят комочек почвы (1/2 чайной ложки), закрывают ватными пробками и термостатируют при 28-30⁰ С.

На 5-6 сутки на поверхности жидкости образуется бурая пленка, при микроскопировании которой обнаруживаются клетки азотобактера в виде кокков и диплококков. Некоторые клетки покрыты слизистой капсулой.

Элективными условиями для азотобактера, способного фиксировать азот атмосферы, являются аэрация, отсутствие в питательной среде азота и присутствие в среде фосфора и кальция, к которым требователен азотобактер.

В некоторых случаях наблюдается вспенивание жидкости в колбе и появление запаха масляной кислоты, что указывает на развитие в среде на дне колбы в анаэробных условиях бактерий Clostridium pasteurianum.

Для изучения морфологии микроорганизмов готовят препараты: один из пленки с поверхности среды для выделения азотобактера (фиксированный препарат, негативно окрашенный тушью); второй из нижних слоев жидкости для выявления клостридий (препарат «раздавленная капля» с добавлением раствора Люголя).

Образование масляной кислоты в среде обнаруживают по реакции с хлорным железом. 5 мл жидкой среды из накопительной культуры переносят в пробирку, добавляют 2 мл 2% раствора хлорнокислого железа и нагревают до кипения. Пары образующегося раствора маслянокислого железа в проходящем свете имеют кроваво-красный цвет.

Экспериментальная часть

Приготовить питательные среды для целюлозоразлагающих и азотфиксирующих бактерий по методике, описанной выше, выделить накопительную культуру этих бактерий.

Затем необходимо взвесить почву и отходы, которые будут подвергаться компостированию, далее следует рассчитать количество воды, необходимой для того, чтобы процесс компостирования происходил в оптимальных условиях - 60%.

На дно 8 сосудов насыпают слой почвы высотой 2 см, следующий слой высотой 10-15 см – отходы растительные отходы (стебли растений, стружка, опилки, семенная шелуха и др.), не допуская уплотнения отходов при засыпании и дозировке. Поверхность отходов засыпают слоем почвы высотой 1,5-2 см.

Два сосуда будут контрольными, в них увлажнение производится только водой без добавки бактериальной суспензии. Увлажняют смесь до 50-60% (количество воды должно быть рассчитано предварительно). Для эксперимента используется предварительно отстоянная водопроводная вода. Воду добавлять осторожно по каплям.

В следующие два отдельных сосуда добавить суспензию целюлозоразлагающих бактерий, в другие два - суспензию азотфиксирующих бактерий, в остальные два – смесь целюлозоразлагающих и азотфиксирующих бактерий. Бактерии вносить вместе с водой, соотношение бактериальной суспензии и воды 1:10.

Через месяц провести химические анализы на содержание С_общ и N_общ во всех рассмотренных вариантах. Каждую неделю измерять температуру компостируемой смеси.

Готовый продукт – биокомпост приобретает темный цвет, запах прелых листьев, имеет высокое содержание питательных веществ, в том числе подвижные формы.