Ферментативные пути образования активных форм кислорода

Кроме неферментативного пути образования АФК в организме человека и животных возможно и ферментативное образование супероксидного анион-радикала и перекиси водорода при окислении органических субстратов различными оксидазами. Примерами могут служить супероксиддисмутаза, трансформирующая супероксидные анион-радикалы в перекись водорода и ксантиноксидаза, образующая супероксидный анион-радикал при окислении ксантина в мочевую кислоту.

В клетках животных организмов ферменты, образующие перекись водорода, локализованы преимущественно в пероксисомах. Кроме ксантиноксидазы в пероксисомах обнаружены уратоксидаза, оксидазы аминокислот, гликолатоксидаза, оксидаза α-гидрооксикислот и ряд других ферментов. Все ферменты пероксисом являются индуцибельными, их активность значительно возрастает при повышении в организме соответствующих субстратов.

Микросомальные монооксигеназы.В микросомах образование супероксидного антион-радикала осуществляется с участием цитохрома Р-450 и цитохрома b_5.

Наиболее многочисленными реакциями являются монооксигеназные реакции, протекающие с участием цитохрома Р450. Монооксигеназы участвуют в синтезе и метаболизме многих физиологически важных соединений, таких как стероидные гормоны, желчные кислоты, витамины, простагландины и др. Кроме этого, важной функцией микросомальных монооксигеназ является детоксикация гидрофобных ксенобиотиков посредством гидроксилирования. НАДФН-цитохром-Р-450-зависимая система гидроксилирования ксенобиотиков содержится, главным образом, в эндоплазматическом ретикулуме большинства органов, за исключением саркоплазматических ретикулумов миокарда и скелетных мышц.

Наряду с монооксигеназной активностью, Р450 может проявлять и оксидазную актиность, генерируя супероксидный анион-радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал.

Рис.2. Образование активных форм кислорода в процессе микросомальных Р_45О – зависимых монооксигеназных реакций (по Е.Б.Меньщиковой с соавт.,2006)

При биотрансформации гидрофобных веществ продукция супероксидных анионов может резко возрастать и возникает реальная угроза токсического поражения организма. Этому противостоит мощная система молекулярных антиоксидантных механизмов, обеспечивающих поддержание гомеостаза.

Ксантиноксидоредуктаза.В нормальных условиях ксантиноксидоредуктаза находится в дегидрогеназной форме и катализирует окисление ксантина с участием НАД в качестве акцептора электронов с образованием мочевой кислоты. Однако при некоторых патологических состояниях, в частности при ишемии органов, в результате активирования внутриклеточных кальцийзависимых протеаз ксантиндегидрогеназа подвергается протеолизу с отщеплением короткого пептида и необратимо превращается оксидазную форму. Акцептором электронов в оксидазной реакции выступает кислород (рис. 3):

Рис.3. Образование мочевой кислоты и супероксидного анион-радикала при окислении пуринов в ксантиноксидоредуктазной реакции.

В организме человека ксантиноксидоредуктаза представлена в наибольшем количестве в клетках печени и тонкого кишечника.

НАДФ-оксидаза. Наряду с ксантиноксидазой мощным продуцентом супероксидного анион-радикала является НАДФН-оксидаза фагоцитирующих клеток. НАДФН-оксидаза представляет собой мультикомпонентную систему, состоящую из цитозольных и мембраносвязанных ферментов. При стимуляции фагоцитов происходит быстрая самосборка этих цитозольных и мембранных компонентов в НАДФН-оксидазный комплекс, осуществляющий перенос электронов с цитозольного НАДФ на молекулярный кислород с образованием супероксидного анион-радикала

Генерация супероксидного анион-радикала при активации фагоцитов играет важную роль в реализации их микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия. В результате дисмутации супероксидный анион-радикал образует перекись водорода, которая используется миелопероксидазой фагоцитов для производства гипохлорит-ионов, обладающих высокой реакционной способностью; перекись водорода при взаимодействии с ионами двухвалентого железа дает гидроксильный радикал, а при реакции с оксидом азота образуется пероксинитрит. Таким образом, супероксидный анион-радикал, генерируемый активными фагоцитами, служит основой для образования других активных свободных радикалов, обеспецивающих микробицидное действие.

NО-синтаза. Ферментативным путем образуется и азотсодержащий радикал кислорода - оксид азота (NO^*). Синтез оксида азота в организме человека и животных происходит при ферментативном окислении L-аргинина. Процесс является довольно сложным и катализируется специфическими ферментами NO-синтазами (NOS), кофакторами выступают НАДФН, тетрагидробиопротеин, флавинадениндинуклетотид и флавинмононуклеотид.

Оксид азота обладает широким спектром биологического действия:

1.Играет ключевую роль в регуляции сосудистого тонуса.

2.Расслабляет гладкую мускулатуру.

3.Предотвращает агрегацию тромбоцитов и адгезию нейтрофилов к эндотелию.

4.Является важным нейромедиатором.

5.Обладает цитотоксической и микробицидной активностью.

Неслучайно поэтому оксид азота называют «сигнальной молекулой жизни».

Действие оксида азота на сердечно-сосудистую систему обусловлено в основном активацией гуанилатциклазы, образованием цГМФ и активацией протеинкиназы G. В гладкомышечных клетках протеинкиназа G фосфорилирует киназу легких цепей миозина, снижая ее сродство к Ca²⁺- кальмодулиновому комплексу. Дефосфорилирование легких цепей миозина препятствует образованию актомиозиновых мостиков, уменьшая силу сокращения гладкомышечных клеток и сосудистый тонус.

При стимуляции рецепторов эндотелиальных клеток некоторыми медиаторами или гормонами происходит повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, активируется эндотелиальнаяNO-синтаза, образующийся оксид азота диффундирует в гладкомышечные клетки и вызывает вазодилятацию. Вазодилятация при физической нагрузке, частично, объясняется тем, что увеличение скорости кровотока повышает концентрацию ионов кальция в эндотелиальных клетках, следовательно, и активность NO-синтазы.

Снижение или отсутствие эндогенной продукции оксида азота при эндотелиальной дисфункции считают одной из ключевых причин развития ишемических и атеросклеротических изменений в коронарных сосудах.

В качестве необходимого компонента оксид азота участвует:

1. В работе желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы.

2. Функционировании секреторных клеток и тканей, в частности, в выработке

инсулина.

3.В работе органов дыхания.

4. Вобеспечении нормального состояния кожного покрова.

5.В развитии болевой реакции.

6.В регуляциитромбообразования и адгезии тромбоцитов на поверхности сосудов в

качестве ингибирующего фактора.

Установлен факт функционирования оксида азота в работе репродуктивной системы животных и человека.

В центральной нервной системе оксид азота обеспечивает выделение нейромедиаторов, участвует в синаптической передаче и формировании длительно функционирующих связей между нейронами – постсинаптической потенциации, лежащей в основе памяти, обучения и творческой деятельности человека в целом. Регуляторные функции оксида азота проявляются при его чрезвычайно низкой концентрации, составляющей всего лишь микро- и даже наномоли на 1 кг ткани. При больших концентрациях оксида азота проявляется цитотоксическое действие, что лежит в основе клеточного иммунитета, обеспечивающего его действие на клетки – мишени. При повышенной генерации оксида азота, которое обнаруживается при разнообразных патологиях в гладкой мускулатуре сосудов, миокарде, нервной ткани и ткани секреторных органов, токсическое действие азота приводит к существенным негативным последствиям. Так, усиленный синтез оксида азота в сосудах при бактериальных инфекциях может вызвать эндосептический шок, обусловленный резким снижением периферического сопротивления кровеносных сосудов из-за их значительного расслабления и быстрым падением давления крови. Эндотоксин стимулирует активность индуцибельной NO-синтазы. Интенсивная и продолжительная активация индуцибельной синтазы оксида азота при септическом шоке сопровождается мощным усилением биосинтеза оксида азота, который играет двойственную роль в патогенезе септического шока. Так, он оказывает защитный антибактериальный эффект, но в то же время проявляет и неблагоприятное действие, включая устойчивую вазодилятацию, гипотензию и гипореактивность по отношению к сосудосуживающим агентам.

Образование оксида азота с участием индуцибельнойNO-синтазы в макрофагах, лимфоцитах и нейтрофилах играет важную роль в иммунных реакциях и в развитии воспаления. Повышение уровня оксида азота в крови больных с выраженной общей воспалительной реакцией играет важную роль в высвобождении интерлейкина-1, интерлейкина-6, интерлейкина-8 и других индукторов воспаления. Бактерицидная, фунгицидная, антипаразитарная, противовирусная и противоопухолевая активности макрофагов могут быть частично обусловлены интенсивной секрецией оксида азота.

NO• нестабилен в физиологических средах, однако он может взаимодействовать с глутатионом с образованием нитрозоглутатиона (GSNO), который значительно более устойчив. GSNO может транспортироваться из клетки в клетку, сохраняться в клетках и выступать в качестве донора NO-радикалов. Так как в клетках млекопитающих концентрации GSH могут достигать 10 мМ, то GSNO может служить одним из главных либераторов NO• в организме и вносить определенный вклад в цитотоксическое действие NO• в отношении внутриклеточных микроорганизмов, в том числе M. Tuberculosis.

Оксид азота при взаимодействии с супероксидным анион-радикалом образует пероксинитрит – ONOO^-, обладающий цитотоксическим и бактерицидным действием. В свою очередь, пероксинитрит под влиянием двухвалентного иона железа превращается в диоксид азота с образованием гидроксильного радикала (реакция А.Н.Осипова). В общем, синтез и окислительные превращения оксида азота могут быть представлены в виде следующей схемы:

Аргинин → NO* + О₂* → ONOO ^- → NO₂ + HO*

Оксид азота способен стимулировать ангиогенез, что чрезвычайно важно в условиях ишемии миокарда. Оксид азота играет существенную роль в модуляции апоптоза клеток интимы как физиологического процесса. Усиление этого явления ассоциировано с атерогенезом, который замедляется при восстановлении нормального уровня оксида азота. Оксид азота параллельно препятствует адгезии и миграции моноцитов в сосудистую стенку, являясь, таким образом, одним из ведущих антисклеротических факторов. Описанные функции рассматриваются как цитопротекторные, особенно на фоне имеющихся кардиоваскулярных нарушений.

В физиологических концентрациях оксид азота выступает преимущественно в роли антиоксиданта, который тормозит развитие радикальных окислительных реакций, связывая свободные и входящие в состав гема ионы двухвалентного железа и ингибируя разложение перекиси водорода и гидроперекисей. Кроме этого, взаимодействуя с гидроперекисными радикалами (ROO* + NO* → ROONO), оксид азота ингибирует развитие цепей свободнорадикальных реакций.

Таким образом, оксид азота как активный биологический агент может оказывать как положительное (регуляторное) действие, так и существенное негативное патологическое действие, лежащих в основе развития многих заболеваний человека.

В практическом здравоохранении широко используются нитратсодержащие противоангинальные препараты (нитроглицерин, нитросорбид, амилнитрит и др.), лечебный эффект которых обосновано связывают с их способностью высвобождать в организме оксид азота. Нитроглицерин входит в клетку, где он трансформируется тиолзависимой ферментной системой в оксид азота и близкородственные соединения. Продолжительное введение нитроглицерина индуцирует состояние толерантности. Показано, что нитроглицерин быстро истощает сульфгидрильные группы, необходимые для его биотрансформации в оксид азота. Введение N-ацетилцистеина обращает толерантность нитроглицерина.

Миелопероксидаза. При взаимодействии перекиси водорода с ионами хлора образуется высокоактиный гипохлорит ион. Реакция катализируется миелопероксидазой (МПО), которая локализуется в азурофильных гранулах нейтрофильных гранулоцитов. МПО (Н₂О₂-оксидоредуктаза) представляет собой гемопротеин, состоящий из двух тяжелых (β) и двух легких (α) субъединиц; β-субъединицы соединены одной дисульфидной связью и содержат 2 ковалентно связанные железосодержащие простетические группы.

Первичным продуктом, образующимся при окислении хлоридов миелоперксидазой, является хлорноватистая (гипохлорная) кислота ((HOCl), которая находится в равновесии с гипохлорит-ионом (OCl^-):

Н ₂О₂ + Cl^−МПОHOCl + OH^-

HOCl → H⁺ + OCl^-

Стимуляция фагоцитоза, сопровождающаяся дегрануляцией нейтрофилов, приводит к высвобождению МПО и образованию гипохлорит иона, являющего важным микробицидным фактором полиморфноядерных лейкоцитов. Гипохлорит-ион является сильным окислителем и поэтому накапливается и хранится в нейтрофилах в специальных гранулах, мембрана которых предохраняет клеточные структуры от повреждающего воздействия гипохлорит-иона.

Гипогалоиды представляют собой мощные токсины, чрезвычайно реакционоспособные в химическом отношении и взаимодействуют с органическими молекулами, либо галогенируя их, либо окисляя. При взаимодействии с гипогалоидами в первую очередь окисляются сульфгидрильные и тиоэфирные группы белков, поэтому наличие в среде белковых молекул, содержащих подобные группы, существенно снижает цитотоксическое действие гипогалоидов. Так, основным сывороточным ингибитором гипогалоидов считается альбумин.

Гипогалоиды способны окислять железосерные центры и гемовые группы ферментов. Гипогалоиды могут как индуцировать, так и ингибировать процессы перекисного окисления липидов. Индукция ПОЛ может быть вызвана освобождением железа в каталитически активной форме (Fe²⁺), одновременно гипохлорит может взаимодействовать с Fe²⁺ с образованием гидроксильного радикала:

F e²⁺ + OCl^- + H⁺ Fe³⁺ + OH^* + Cl^-

Установлено, что гипохлорит-ион легко проникает в поверхностный фосфолипидный слой циркулирующих в крови липопротеидов низкой плотности и, вызывая их окисление, индуцирует тем самым эффективный захват окисленных липопротеинов макрофагами через «скэвэнджер»-рецепторы.

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ

Реакции перекисного окисления липидов являются свободнорадикальными и постоянно происходят в организме. Наиболее подвержены действию активных форм кислорода жирные кислоты, содержащие изолированные двойные связи, расположенные через СН₂-группу. Именно от этой СН₂-группы свободный радикал (инициатор окисления) легко отнимает электрон, превращая липид, содержащий эту кислоту, в свободный радикал. ПОЛ характеризуют цепные реакции, обеспечивающие расширенное воспроизводство свободных радикалов, частиц, имеющих неспаренный электрон, которые инициируют дальнейшее развитие перекисного окисления.

Зарождение цепи СРОЛ начинается с образования свободного радикального соединения. Этот радикал образуется в акте одноэлектронного окисления при отрыве гидроксильным радикалом атома водорода от молекулы ненасыщенной жирной кислоты. Наименьшую энергию нужно затратить при отрыве водородного атома от углерода, находящегося в альфа- положении по отношению к двойной связи. Олеиновая, линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты содержат соответственно 1,2,3,4, таких альфа углеродных атома:

αα

СН - (СН ) - СН – СН = СН – СН – СН = СН – СН – (СН ) – СООН

Этим и объясняется увеличение реакционной способности ненасыщенных жирных кислот с увеличением числа двойных связей.

Свободнорадикальная атака НО^• альфа- углеродного атома, сопровождающаяся отрывом от него одного атома водорода, приводит к появлению свободного π- электрона в системе сопряженных двойных связей:

Стадии перекисного окисления липидов

1. Инициация: образование свободного радикала (L•)

Инициирует реакцию чаще всего гидроксильный радикал, отнимающий водород от СН₂-групп полиеновой кислоты, что приводит к образованию липидного радикала.