МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

ПО ОБЩЕЙ МИКРОБИОЛОГИИ

ДЛЯ СПЕЦИАЛЬНОСТЕЙ:040100 – ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЛО

040400 – СТОМАТОЛОГИЯ

Нальчик 2005

УДК 576.8 (075)

ББК 28.4 я73

Г12

Рецензент:

Доцент кафедры микробиологии Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии Якушенко О.С.

Составители: Габрилович И.М., Блиева Л.З., Хараева З.Ф.

Методические указания к лабораторным занятиям по общей микробиологии. Методические разработки. – Нальчик:Каб.-Балк.университет, 2006 -155с.

В методических разработках содержится описание лабораторных занятий по разделам общей микробиологии. К каждой теме дается краткая характеристика темы занятия, список заданий по лабораторному практикуму и контрольные вопросы. Издание предназначено для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по микробиологии и контроля усвоения материала.

Рекомендовано РИСом университета

УДК 576.8 (075)

ББК 28.4 я73

Кабардино-Балкарский государственный университет, 2005

РАЗДЕЛ I. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

ТЕМА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ

Лабораторные занятия по микробиологии, вирусологии и иммунологии начинаются с ознакомления студентов с организацией микробио­логической лаборатории, её оборудованием, основными методами ис­следования.

В микробиологических лабораториях выполняется бактериологичес­кие, вирусологические и серологические анализы материалов, полу­ченных от больных (с целью диагностики заболеваний), обследуются бактерионосители и проводятся санитарно – микробиологические исследования воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов. Микробиологические лаборатории создаются при лечебных, учебных и научных учреж­дениях, санитарно – эпидемиологических станциях (СЭС).

Работа с болезнетворными микробами требует обязательного соб­людения ряда правил личной профилактики.

Правила работы в микробиологических лабораториях

1. Работа в лаборатории должна проводиться в сменной обуви, в медицинских халатах и шапочках. В необходимых случаях на лицо на­девается маска. При работе с особо опасными микроорганизмами не­обходимо руководствоваться специальными инструкциями.

2. В лаборатории не разрешается курить и принимать пищу, а также делать лишние передвижения.

3. Рабочее место должно быть в образцовом порядке, личные вещи следует хранить в специально отведенных местах. Из личных ве­щей студента на рабочем столе допускается иметь только рабочую тетрадь, в которой делаются записи и зарисовки.

4. При случайном попадании заразного материала на стол или на пол это место тщательно обрабатывается дезинфицирующим раствором.

5. После окончания работы нужно тщательно вымыть руки и при необходимости обработать их дезинфицирующим раствором.

6. Хранение и уничтожение микроорганизмов проводится соглас­но специальным инструкциям.

Методы микробиологических исследований

Все микробиологические исследования могут быть сведены к 5 основным методам:

– микроскопический метод состоит в изучении исследуемого материала с помощью различных микроскопов;

– бактериологический (микологический, ви­русологический) метод заключается в искусственном культивирова­нии микроорганизмов и выделении чистых культур с последующей их идентификацией (определением вида);

– серологический метод основан на определении специфических антител к антигенам в крови и других биологических жидкостях пораженного организма с помощью различных реакций им­мунитета;

– биологический; или экспериментальный, метод заключается в заражении животных исследуемым материалом с целью воспроизведения инфекционного заболевания или последующего вы­деления возбудителя;

– аллергический метод заключается в постановке кожных аллергических проб с соответствующими аллергенами с целью обнаружения повышенной чувствительности макроорганизма к опреде­ленным возбудителям инфекционных заболеваний или продуктам их жизнедеятельности.

Микроскопический метод исследования

Изучение морфологии микроорганизмов ввиду их малой величины возможно только с помощью микроскопа. Для микробиологических ис­следований используют несколько типов микроскопов (биологичес­кий, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроско­пии.

Современные световые микроскопы характеризуются пре­дельной разрешающей способностью 0,2 мкм, под которой понимают наименьшее расстояние между двумя точками, различимое с помощью микроскопа. Разрешающая способность микроскопа (d) описывается формулой: d =/NA, где  – длина волны проходящего света, NА – численная (нумерическая) апертура объектива, равная nsin (n – показатель преломления среды между объектом и объективом, а  – половина отверстного угла, образуемого двумя крайними лучами, попадающими в объектив). Для иммерсионных объек­тивов NA=1,25, для объективов сильного увеличения – 0,65, для объективов слабого увеличения – 0,2.

Общее увеличение микроскопа определяется произведением увели­чения объектива на увеличение окуляра. В повседневной практике обычно используют увеличение порядка 630 – 900.

Основными разновидностями метода световой микроскопии являются:

Микроскопия в темном поле. Ее применяют для изучения неокрашенных микробов, их подвижности. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной цент­ральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лу­чей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи. В связи с этим поле зрения остается неосвещенным, в то время как объекты, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне.

Люминесцентная микроскопия. Люминесценция – это свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией (коротковолновая и ультрафиолетовая части спектра). Мик­робы обладают слабой собственной первичной люминесценцией, и по­этому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами; люминесцирующих красителей – флюорохромами, которые светятся под влиянием ультрафиолетовых и коротковолновых синих лучей. Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, т. е. связываются с отдельными клеточными структурами (ядро, цитоплазма, включения). Для люминесцентной микроскопии необходим источник ультрафиолетового света и набор светофильтров.

Фазово–контрастная микроскопия. Изучение живых неокрашенных микробов затруднено в связи с их ма­лой контрастностью. В видимом свете они прозрачны. Однако при про­хождении света через микробную клетку происходит изменение фазы световых лучей, что обусловлено различиями толщины и показателей преломления отдельных структур. Эти изменения могут быть обнаруже­ны при использовании специальных фазово–контрастных устройств, в результате чего микроорганизмы и отдельные части микробной клет­ки становятся контрастными и видимыми человеческим глазом.

В электронном микроскопе вместо световых лучей ис­пользуется поток электронов, излучаемых специальным источником (электронная пушка). На пути потока электронов помещены электро­магнитные линзы, которые для электронных лучей являются фокусирую­щими, т. е. действует подобно линзам для световых лучей. Исследуе­мый препарат, приготовленный на тончайшей пленке, помещают в без­воздушной среде на пути потока электронов после их прохождения через конденсорную линзу. Затем пучок электронов проходит через объективную и проекционные линзы. Изображение микроскопируемого объекта наблюдают на флюоресцирующем экране. Возникновение изображения на экране обусловлено тем, что различные части исследуемого объекта обладают неодинаковой проницаемостью для электронов.

Электронная микроскопия дает возможность изучать объекты вели­чиной 10 – 10000 нм. Ее широко применяют для исследования тончайших структур бактериальной клетки и функциональных особенностей ее компонентов, для изучения морфологии и биологических свойств вирусов и фагов.

В сканирующем-зондовом микроскопе используют используют комбинации инвертированного оптического и зондового микроскопов. Минимальный шаг сканирования составляет 0,01нм. Сканирующая-зондовая микроскопия применяется для определения плотности и размеров бактерий и вирусов, определения параметров состояния мембран (эластичности, проводимости), исследования структуры ДНК, особенностей биомакромолекул и антигенов поверхности клеток.

ЗАДАНИЕ

1. Ознакомиться с основным оборудованием микробиологической лаборатории, с лабораторной посудой, оборудованием рабочего места.

Микробиологическая лаборатория должна иметь лабораторные столы, покрытые материалами (линолеум, пластик), которые хорошо моются и могут подвергаться обработке дезинфицирующими растворами; винтовые табуреты, удобные как для микроскопирования, так и для другой работы; шкафы для посуды, питательных сред, реактивов.

Необходимым оборудованием микробиологической лаборатории являются: термостат, автоклав, сушильный шкаф, микроанаэростат, компрес­сор, холодильники, центрифуги, весы лабораторные и аналитические. Лаборатория оснащается необходимой посудой и инструментарием: про­бирки бактериологические, серологические и центрифужные, чашки Петри, пипетки градуированные и пастеровские, стекла предметные и покровные, наборы инструментов, шприцы, стерилизаторы для инструментов, водяные бани, аппаратура для фильтрования и др. Для повсе­дневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими сыворот­ками и другими и лабораторными материалами.

Лабораторный стол оборудуется биологическим микроскопом, иммерсионным маслом, газовыми горелками (или спиртовками), бактериологической петлей, дезинфицирующим раствором, штативом для пробирок. Для окраски препаратов на столе должны находиться набор красите­лей, спирт, фильтровальная бумага, эмалированный кювет, емкость с водой, предметные стекла, пинцет для извлечения стекол, банка для отработанных стекол.

2. Освоить особенности работы с иммерсионной системой микроско­па при исследовании готовых препаратов.

При иммерсионной микроскопии окрашенных препаратов необходимо создавать хорошее освещение, для чего надо максимально поднять конденсор, открыть диафрагму конденсора, поставить малый сухой объектив на расстоянии 5 – 7 см от предметного столика и с помощью плоского зеркала установить равномерное освещение поля зрения. При работе с иммерсионной системой во избежание порчи объектива необходимо соблюдать следующие правила: после нанесения на поверхность препарата небольшой капли иммерсионного масла под контролем глаза сбоку погрузить в нее фронтальную линзу иммер­сионного объектива, а затем, глядя в окуляр, при помощи сначала макрометрического, а затем микрометрического винта установить препарат в фокусе микроскопа. Микроскопирование необходимо про­водить, не снимая руки с микрометрического винта, что дает воз­можность, изменяя фокусное расстояние, рассмотреть всю поверх­ность поля зрения. После работы иммерсионная система и столик микроскопа должны быть очищены от масла.

3. Микроскопировать нативные препараты бактерий.

При микроскопировании живых микроорганизмов можно, наряду с формой бактерий, наблюдать за их подвижностью, а также определить количество клеток в исследуемом объеме. Живые микроорганиз­мы исследуют в препаратах "висячая" и "раздавленная" капля.

Приготовление препарата "висячая капля"

На середину покровного стекла нанести каплю исследуемой жид­кой культуры. Каплей вниз опустить покровное стекло на предметное стек­ло с углублением (лункой), края которого смазаны вазелином. Кап­ля должна свободно свисать и не касаться дна краев углубления. Создается герметически закрытая камера, в которой бактерии можно наблюдать длительное время (4-6 часов). При малом увеличении найти край кап­ли, после чего переместить ее в центр поля зрения и микроскопировать с объективом сильного увеличения и с иммерсионным объективом.

Приготовление препарата "раздавленная капля"

На середину предметного стекла нанести каплю жидкой бактери­альной культуры. Осторожно накрыть её покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха, после чего микроскопировать с малым сухим, а затем с большим сухим и иммерсионным объективами.

Прижизненная окраска бактерий

Для такой окраски применяются сильно разбавленные растворы кра­сителей, которые не оказывают токсического действия на бактерии. На предметное стекло нанести каплю 0,001% раствора метиленового синего, в которую внести взвесь бактерий, после чего приготовить препарат "раздавленная капля" и микроскопировать его.

Контрольные вопросы

1. Что является предметом изучения микробиологии?

2. Какие разделы включает микробиология?

3. Основные этапы развития микробиологии.

4. Каковы принципы таксономии микроорганизмов?

5. В чем состоит нумерическая таксономия микроорганизмов?

6. Как строится номенклатура микроорганизмов?

7. Каково назначение микробиологической лаборатории?

8. В чем состоят основные правила работы в микробиологической лаборатории?

9. Каковы методы микробиологических исследований?

10. Из каких частей состоит биологический микроскоп?

11. Как определить увеличение микроскопа?

12. Что собой представляет разрешающая способность микроскопа? От чего она зависит?

13. Какие существуют методы микроскопирования?

14. Каковы правила работы с сухими объективами?

15. В чем состоит принцип иммерсионной микроскопии?

16. Каковы правила иммерсионной микроскопии?

17. В чем состоит фазово – контрастная микроскопия? Ее применение.

18. С какой целью применяется темнопольная микроскопия?

19. Каков принцип люминесцентной микроскопии?

20. В чем состоит электронная микроскопия? Каковы ее возможности?

21. В чем состоит принцип сканирущей-зондовой микрскопии?

22. Какими методами исследуются нативные препараты бактерий?

23. В чем состоит приготовление препарата "висячая капля"?

24. Как готовится препарат "раздавленная капля"?

25. В чем состоит прижизненная окраска бактерий?

Тема 2. МикрОскопический метод исследования: морфология и структура бактерий. Приготовление фиксированных препаратов, простые и сложные методы окраски

Всем бактериям присущи определенная форма и размеры, которые выражаются в микрометрах. Они варьируют в широких пределах – от 0,1 – 0,15 мкм (Mycoplasma) до 10 – 15 мкм (Clostridium) в длине и от 0,1 мкм до 1,5 – 2,5 мкм в диаметре. Бόльшая часть бактерий имеет размеры от 0,5 – 0,8 мкм до 2 – 3 мкм.

Различают следующие основные формы бактерий: шаровидные (сферические), или кокковидные, палочковидные (цилиндрические), извитые (спиралевидные), нитевидные. Существуют бактерии, имеющие треугольную форму. Обнаружены так называемые квадратные бактерии, которые образуют скопления из 8 или 16 клеток в виде пласта.

Организация бактериальной клетки такова, что она позволяет ей координировать все процессы жизнедеятельности, за определенный срок удваивать свою биомассу и размножаться путём бинарного деления. В составе бактериальной клетки можно выделить различные структуры: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид, мезосому, периплазматическое пространство, цитоплазматические включения, рибосомы, капсулу, микрокапсулу, жгутик, плазмиды, пили, фимбрии, перемычки в периплазматическом пространстве.

Клеточная стенка – структурный компонент, присущий только бактериям:

• сохраняет постоянную форму клетки;

• защищает внутреннюю часть клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды; участвует в регуляции роста и деления клеток;

• обеспечивает коммуникацию с внешней средой через каналы и поры;

• несёт на себе специфические рецепторы для бактериофагов;

• определяет антигенную характеристику бактерий;

• содержащийся в её составе пептидогликан наделяет клетку важными иммунобиологическими свойствами;

Нарушение синтеза клеточной стенки бактерий является главной причиной их L – трансформации. Структура и химический состав клеточной стенки у разных бактерий не одинаков. По окраске мазков по методу Грама все бактерии дифференцируют на грамположительные и грамотрицательные, которые характеризуются отличительными особенностями (табл. 1).

Таблица 1

Особенности клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий

Признак и компоненты	Грамположительные	Грамотрицательные
Структура	однородная	слоистая
Толщина	20 – 60нм	14 – 18 нм
Ригидный и пластичный	связаны ковалентно	связаны лабильно
Пептидогликан	до 90% сухой массы, предст. 5 – 6 слоями, часто не содержит диаминопимелиновую кислоту	до 5 – 10% сухой массы предст. 1 – 2 слоями, содержит диаминопимелиновую кислоту
Тейховые кислоты	до 50% сухой массы	отсутствуют
Наружная мембрана	у некоторых имеются токсические гликолипиды; липополисахариды отсутствуют	представлена липопротеинами, фосфолипидами, липополисахаридами
Белки	белки, определяющие антигенную специфичность	белки – порины
Чувствительность к пенициллинам и лизоциму	высоко чувствительна	менее чувствительна
Представители	бациллы, клостридии, коринебактерии, стафилококки, стрептококки, пептококки	энтеробактерии, вибрионы, нейссерии, вейлонеллы, бактероиды, спириллы, псевдомонады

Цитоплазматическая мембрана является полифункциональной структурой. Выполняет следующие функции:

• воспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды;

• является основным осмотическим барьером, благодаря которому внутри клетки поддерживается определенное осмотическое давление;

• совместно с клеточной стенкой участвует в регуляции роста и клеточного деления бактерий;

• участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид;

• в цитоплазматической мембране содержится значительное количество ферментов, в том числе системы переноса электронов;

• участвует в процессах транспорта питательных веществ в клетку и продуктов жизнедеятельности из клетки в окружающую среду;

• участвует в синтезе компонентов клеточной стенки и образовании мезосом;

• с цитоплазматической мембраной связаны жгутики и аппарат регуляции их движения.

Цитоплазма бактерий представляет собой сложную коллоидную систему. Она неподвижна. В цитоплазме располагаются ядерный аппарат – нуклеоид, плазмиды, рибосомы, мезосомы, различные включения.

Нуклеоид состоит из одной замкнутой спиральной нити ДНК. Длина нити – около 1 мм. Это одиночная бактериальная хромосома. В нуклеоиде также находятся РНК – полимераза, основные белки (но не гистоны). Бактериальная хромосома имеет вид бус. Один конец её часто связан с мезосомой.

Плазмиды – внехромосомные генетические структуры бактерий. Представляют собой замкнутую молекулу двухнитчатой ДНК, связанную с белком. Локализуются в цитоплазме клетки или в состоянии интеграции с хромосомой. Приобретение или утрата плазмид приводит к приобретению или утрате одного или нескольких признаков, хотя существуют «немые» плазмиды. Наиболее известны F – плазмида, R – фактор, Col – плазмида.

Мезосомы – мембранные структуры бактерий, выполняющие функцию генерации энергии, аналоги митохондрий эукариот. Способны ассоциироваться с рибосомами. Представляют собой инвагинации цитоплазматической мембраны, на которой локализованы ферменты дыхания.

Рибосомы – внутриклеточные органоиды, осуществляющие синтез белка. Состоят из белка и трех типов РНК, построены из 2 субъединиц. Бактериальные рибосомы не связаны с мембранным аппаратом, имеют константу седиментации 70S.

Для изучения морфологии бактерий из них готовят нативные (прижизненные) препараты и фиксированные мазки. Фиксированные окрашенные препараты позволяют разграничить бактерии, выявлять детали строения микробной клетки, они удобны в практической работе, особенно при изучении патогенных микроорганизмов. Подготовка фиксированных препаратов включает приготовление мазка, высушивание его, фиксацию и окрашивание мазка.

Для приготовления мазка на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал с плотной питательной среды и распределяют так, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1 – 1,5 см. При приготовлении мазков из жидких культур исследуемый материал непосредственно наносится на предметное стекло.

Высушивание мазка проводится на воздухе или в струе тёплого воздуха.

Фиксация мазка производится с целью прикрепления микроорганизмов к стеклу и обеззараживания препарата. Кроме того, фиксированные бактерии лучше воспринимают красители. Для фиксации мазков высушенный препарат проводят 3 – 4 раза через пламя горелки, причём в пламени препарат следует выдерживать не более 2 секунд. Если фиксация проведена правильно, стекло при прикосновении к тыльной поверхности руки тотчас после окончания процесса фиксации слегка обжигает кожу. В некоторых случаях мазки можно фиксировать путем погружения в этиловый спирт на 15 – 20 минут, в смесь равных объёмов этилового спирта и эфира (смесь Никифорова) на 15 – 20 минут, в ацетон на 5 минут.

Окрашивание мазков осуществляется растворами анилиновых красителей. В основе окраски лежат сложные химические и физико – химические процессы взаимодействия компонентов микробной клетки с анилиновыми красителями. Красящая способность последних зависит от наличия у них карбоксильных, серосодержащих, аминогрупп, от заряда микробной клетки. Для окраски микроорганизмов используют, главным образом, основные красители­­ - метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый, фуксин, гематоксилин, везувин и др.. Для выявления различных структурных элементов бактериальной клетки применяют нейтральные и кислые красители­­ (нейтральный красный, кислый фуксин, Конго, пикриновая кислота и др.). Отношение микроорганизмов к красителям определяет их тинкториальные свойства.

Различают простые и сложные методы окраски. Первые состоят в окрашивании мазков одним красителем и дают возможность ознакомиться с общей морфологией микробов. Сложные, или дифференцированные, способы окраски производятся различными красителями и применяются для детального изучения структуры клетки, а также для характеристики и дифференциации данного микроба от других.

ЗАДАНИЕ

1. Приготовить мазки из жидкой культуры бактерий и с плотной питательной среды.

2. Окрасить мазок простым способом, для чего на фиксированный препарат нанести водный раствор фуксина (фуксин Пфейффера) на 1 – 2 мин или раствор метиленового синего на 3 – 5 мин, затем краску слить, препарат ополоснуть водой и просушить с помощью фильтровальной бумаги. Микроскопировать с иммерсионной системой и зарисовать.

3. Окрасить мазок дифференцированным методом.

Техника окраски по Граму

а) на фиксированный препарат поместить полоску фильтровальной бумаги и на неё нанести раствор­­ карболового генцианвиолета на 1 – 2 минуты;

б) краситель слить, снять фильтровальную бумагу и обработать препарат в течение 1 – 2 минут раствором Люголя до почернения препарата;

в) слить раствор Люголя и на препарат нанести несколько капель этилового спирта на 30 – 60 сек;

г) промыть водой и докрасить препарат водным фуксином в течение 1 – 2 минут;

д) слить краску, промыть водой, высушить и микроскопировать препарат с иммерсионной системой.

При данном методе одни бактерии окрашиваются в тёмно – фиолетовый цвет (грамположительные), другие – в красный или розовый (грамотрицательные). Сущность метода состоит в том, что клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксируют комплекс генцианвиолет – раствор Люголя, не обесцвечивается этанолом и потому не воспринимает дополнительный краситель (фуксин). У грамотрицательных микробов комплекс легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем.

Зарисовать грамположительные и грамотрицательные бактерии.

4. Изучить в готовых препаратах различные формы микроорганизмов: шаровидные, палочковидные, извитые, нитевидные.